Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Zusammenfassung

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Zusammenfassung

Die Lichtblattmikroskopie (LSM) spielt eine entscheidende Rolle beim Verständnis der komplizierten dreidimensionalen (3D) Struktur des Herzens und liefert entscheidende Einblicke in die grundlegende Herzphysiologie und pathologische Reaktionen. Wir befassen uns mit der Entwicklung und Implementierung der LSM-Technik, um die Mikroarchitektur des Herzens in Mausmodellen aufzuklären. Die Methodik integriert ein maßgeschneidertes LSM-System mit Gewebereinigungstechniken, um die Lichtstreuung im Herzgewebe für die volumetrische Bildgebung zu verringern. Die Kombination von konventionellem LSM mit Image Stitching und Multiview-Dekonvolutionsansätzen ermöglicht die Erfassung des gesamten Herzens. Um den inhärenten Kompromiss zwischen axialer Auflösung und Sichtfeld (FOV) zu adressieren, führen wir außerdem eine axial gesweepte Lichtblattmikroskopie (ASLM) Methode ein, um unscharfes Licht zu minimieren und das Herz gleichmäßig über die Ausbreitungsrichtung zu beleuchten. In der Zwischenzeit verbessern Gewebereinigungsmethoden wie iDISCO die Lichtdurchdringung, erleichtern die Visualisierung tiefer Strukturen und gewährleisten eine umfassende Untersuchung des Myokards im gesamten Herzen. Die Kombination der vorgeschlagenen LSM- und Gewebereinigungsmethoden stellt eine vielversprechende Plattform für Forscher bei der Aufklärung kardialer Strukturen in Nagetierherzen dar, die ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Einleitung

Herzinsuffizienz ist nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit, was vor allem auf die mangelnde Regenerationsfähigkeit reifer Kardiomyozyten^{zurückzuführen ist 1}. Die komplizierte Architektur des Herzens spielt eine entscheidende Rolle für seine Funktion und gibt Einblicke in Entwicklungsprozesse. Ein tiefgreifendes Verständnis der kardialen Struktur ist unerlässlich, um die grundlegenden Prozesse der kardialen Morphogenese und des Umbaus als Reaktion auf einen Myokardinfarkt aufzuklären. Jüngste Fortschritte haben gezeigt, dass neugeborene Mäuse die Herzfunktion nach einer Verletzung wiederherstellen können, während erwachsenen Mäusen ei....

Protokoll

Tierversuche und -versuche wurden genehmigt und unter der Aufsicht des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas in Dallas (IACUC #21-03) durchgeführt. In dieser Studie wurden C57BL6-Mäuse, einschließlich Neugeborene am postnatalen Tag 1 (P1) und 8 Wochen alte Erwachsene, verwendet. Es wurde kein Unterschied zwischen Männchen und Weibchen beobachtet. Die gesamte Datenerfassung und Bildnachbearbeitung erfolgte mit Open-Source-Software oder Plattformen mit Forschungs- oder Bildungslizenzen. Die Ressourcen sind auf begründete Anfrage bei den Autoren erhältlich.

1. Probenvorbereitung und Gewebereinigung (6 - 10 T....

Diskussion

Die Weiterentwicklung von Bildgebungs-, Berechnungs- und Gewebereinigungsmethoden hat eine beispiellose Gelegenheit geboten, die Struktur und Funktion des Herzens umfassend zu untersuchen. Dies birgt ein großes Potenzial für die Vertiefung unseres Verständnisses der kardialen Morphogenese und Pathogenese anhand eines intakten Nagetierherzmodells. Im Gegensatz zu In-vivo-Studien an Zebrafischherzen mit einem ähnlichen Ansatz 40,41,42,43 ermöglicht uns die Integration fortschrittlicher LSM-Techniken und Geweb.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Agarose
Low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
Chemicals for tissue clearing
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans	Sigma-Aldrich	118184
D.E.R.™ 332	Sigma-Aldrich	31185
D.E.R.™ 736	Sigma-Aldrich	31191
Dibenzyl ether (DBE)	Sigma-Aldrich	33630
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich	216736
Methanol	Sigma-Aldrich	439193
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Fisher	47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	79383
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Software and algorithms
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
BigStitcher	Hörl et al.22
Fiji-ImageJ	Schindelin et al.20	1.54f
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body	Olympus	MVX-ZB10
10X Illumination objective	Nikon	MRH00105
1X detection objective	Olympus	MV PLAPO 1X/0.25
473nm DPSS Laser	Laserglow Technologies	LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector	National Instrument	BNC-2110
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes	Physik Instrumente	C-884.4DC
ETL	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable	Optotune	CAB-6-300
ETL Lens Driver	Optotune	EL-E-4i
Filter	Chroma	ET525/30
Filter	Chroma	ET585-40
Filter	Chroma	ET645-75
Filter wheel	Shutter Instrument	LAMBDA 10-B
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.20DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.40DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	M-403.4PD
NI multifunction I/O	National Instrument	PCIe-6363
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Stepper motor	Pololu	1474
Tube lens	Olympus	MVX-TLU