Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Zusammenfassung

Die Lichtblattmikroskopie hat sich zur Methode der Wahl für die Live-Bildgebung von Zebrafischembryonen über lange Zeiträume mit minimaler Phototoxizität entwickelt. Insbesondere ein Multiview-System, das eine Probenrotation ermöglicht, ermöglicht die Bildgebung ganzer Embryonen aus verschiedenen Blickwinkeln. Bei den meisten Bildgebungssitzungen mit einem Multiview-System ist die Probenmontage jedoch ein mühsamer Prozess, da die Proben in der Regel in einem Polymerröhrchen vorbereitet werden. Um diesen Prozess zu unterstützen, beschreibt dieses Protokoll grundlegende Aufstiegsstrategien für die Abbildung der frühen Entwicklung von Zebrafischen zwischen dem 70%-Epibolie- und dem frühen Somitenstadium. Konkret liefert die Studie Statistiken über die verschiedenen Positionen, in denen sich die Embryonen in den 70% Epibolie- und Knospenstadien innerhalb des Chorions befinden. Darüber hinaus wird die optimale Anzahl von Winkeln und das Intervall zwischen den Winkeln diskutiert, die für die Abbildung ganzer Zebrafischembryonen in den frühen Entwicklungsstadien erforderlich sind, damit durch Verschmelzung der verschiedenen Ansichten Informationen auf zellulärer Ebene extrahiert werden können. Da der Embryo schließlich das gesamte Sichtfeld der Kamera abdeckt, was erforderlich ist, um eine Auflösung im Zellmaßstab zu erhalten, beschreibt dieses Protokoll den Prozess der Verwendung von Perleninformationen von oberhalb oder unterhalb des Embryos für die Registrierung der verschiedenen Ansichten.

Einleitung

Die Gewährleistung einer minimalen Phototoxizität ist eine wichtige Voraussetzung für die Bildgebung lebender Embryonen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung über lange Zeiträume. In den letzten zehn Jahren hat sich die Lichtblattmikroskopie zur Methode der Wahl entwickelt, um diese Anforderung zu erfüllen 1,2,3,4,5,6,7. Kurz^{gesagt, bei} dieser Technik, die erstmals 2004 zur Erfas....

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Erhaltungs- und Versuchsverfahren für Zebrafische wurden von der institutionellen Tierethikkommission unter den Aktenzeichen TIFR/IAEC/2023-1 und TIFR/IAEC/2023-5 genehmigt. Embryonen, die durch Kreuzung heterozygoter Fische gewonnen wurden, die Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ exprimieren, wurden im Einzelzellstadium mit H2A-mCherry-mRNA (30 pg) injiziert. Die H2A-mCherry-mRNA wurde mit dem pCS2+ H2A-mCherry-Plasmid (ein Geschenk des Labors von Oates, EPFL) durch in vitro-Transkription synthetisiert. Embryonen, die beide Marker exprimierten, die im Rest des Protokolls....

Diskussion

Die Positionierung eines Embryos in der richtigen Ausrichtung, um die interessierende Region abzubilden, ist einer der geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte, der oft zu einer fehlgeschlagenen Mikroskopiesitzung für eine Anwenderin führt. Dies gilt umso mehr für ein Multiview-Lichtblattmikroskop, bei dem die manuelle Manipulation der Ausrichtung schwierig ist, da die Proben in eine Röhre eingebettet sind. Um diesen Prozess zu unterstützen, berichtet diese Studie über die Statistik v.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss