Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Zusammenfassung

Die Lichtblattmikroskopie hat sich zur Methode der Wahl für die Live-Bildgebung von Zebrafischembryonen über lange Zeiträume mit minimaler Phototoxizität entwickelt. Insbesondere ein Multiview-System, das eine Probenrotation ermöglicht, ermöglicht die Bildgebung ganzer Embryonen aus verschiedenen Blickwinkeln. Bei den meisten Bildgebungssitzungen mit einem Multiview-System ist die Probenmontage jedoch ein mühsamer Prozess, da die Proben in der Regel in einem Polymerröhrchen vorbereitet werden. Um diesen Prozess zu unterstützen, beschreibt dieses Protokoll grundlegende Aufstiegsstrategien für die Abbildung der frühen Entwicklung von Zebrafischen zwischen dem 70%-Epibolie- und dem frühen Somitenstadium. Konkret liefert die Studie Statistiken über die verschiedenen Positionen, in denen sich die Embryonen in den 70% Epibolie- und Knospenstadien innerhalb des Chorions befinden. Darüber hinaus wird die optimale Anzahl von Winkeln und das Intervall zwischen den Winkeln diskutiert, die für die Abbildung ganzer Zebrafischembryonen in den frühen Entwicklungsstadien erforderlich sind, damit durch Verschmelzung der verschiedenen Ansichten Informationen auf zellulärer Ebene extrahiert werden können. Da der Embryo schließlich das gesamte Sichtfeld der Kamera abdeckt, was erforderlich ist, um eine Auflösung im Zellmaßstab zu erhalten, beschreibt dieses Protokoll den Prozess der Verwendung von Perleninformationen von oberhalb oder unterhalb des Embryos für die Registrierung der verschiedenen Ansichten.

Einleitung

Die Gewährleistung einer minimalen Phototoxizität ist eine wichtige Voraussetzung für die Bildgebung lebender Embryonen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung über lange Zeiträume. In den letzten zehn Jahren hat sich die Lichtblattmikroskopie zur Methode der Wahl entwickelt, um diese Anforderung zu erfüllen 1,2,3,4,5,6,7. Kurz^{gesagt, bei} dieser Technik, die erstmals 2004 zur Erfassung von Entwicklungsprozessen 8 eingesetzt wurde, passieren zwei ausgerichtete dünne Laserschichten den Embryo von gegenüberliegenden Enden und beleuchten nur die interessierende Ebene. Ein Detektionsobjektiv wird orthogonal platziert, und dann wird das emittierte Fluoreszenzlicht von allen beleuchteten Punkten in der Probe gleichzeitig gesammelt. Ein 3D-Bild wird dann erhalten, indem der Embryo nacheinander durch das statische Lichtblatt bewegt wird.

Darüber hinaus können in einer speziellen Form dieser Methodik, die als Multiview-Lichtblattmikroskopie bezeichnet wird, die Proben in einem Polymerröhrchen suspendiert werden, das mit Hilfe eines Rotors gedreht werden kann, was die Abbildung desselben Embryos aus mehreren Winkeln ermöglicht ^9,10,11. Nach der Bildgebung werden die Bilder aus mehreren Blickwinkeln auf der Grundlage von Registrierungsmarkern fusioniert, bei denen es sich in der Regel um kugelförmige Fluoreszenzmarker im Embryo (z. B. Zellkerne) oder in der Röhre (z. B. fluoreszierende Kügelchen) handelt. Multiview-Bildgebung und -Fusion verbessern die axiale Auflösung erheblich und bieten eine isotrope Auflösung über alle drei Dimensionen¹². Dies ist zwar ein großer Vorteil, aber eine große Herausforderung der Multiview-Methodik ist die Probenaufnahme, bei der die Embryonen während des gesamten Verlaufs der Bildgebung in den Eileitern montiert und an Ort und Stelle gehalten werden müssen.

Für die Durchführung von Multiview-Bildgebungen, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten und Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern, können Embryonen in Agarose eingebettet werden. Dies führt jedoch oft zu einem nachteiligen Wachstum und einer nachteiligen Entwicklung, insbesondere bei Zebrafischembryonen im Frühstadium¹³, dem Modellsystem, das hier diskutiert wird. Eine zweite Montagestrategie besteht darin, einen dünnen Schlauch zu verwenden, der nur geringfügig größer als der Durchmesser des Embryos ist, wobei der Embryo zusammen mit dem Embryomedium in den Schlauch gezogen werden kann, gefolgt von dem Verschließen des Bodens des Schlauches mit einem Agarose-Stopfen¹⁴. Da bei dieser Methode das Röhrchen mit Embryomedium gefüllt ist, können Registrierungsmarker wie fluoreszierende Kügelchen nicht für die Verschmelzung der verschiedenen Ansichten verwendet werden, und die Registrierung ist daher auf Marker innerhalb des Embryos angewiesen. Im Allgemeinen fungieren Kügelchen als bessere Registrierungsmarker, da das Signal der Marker im Embryo abnimmt, wenn es tiefer in die Probe eindringt, was sowohl auf Beleuchtungs- als auch auf Detektionseinschränkungen eines Mikroskops zurückzuführen ist.

Ein dritter Ansatz, der hier detailliert beschrieben^{und zuvor} 5,13,14,15,16 verwendet wurde, besteht darin, frühe Zebrafischembryonen mit einem intakten Chorion abzubilden und die Röhre mit einem minimalen Prozentsatz an Agarose zu füllen, die Kügelchen als Registrierungsmarker enthält. Da in diesem Szenario ein manueller Eingriff zur Positionierung von Embryonen innerhalb eines Chorions nicht möglich ist, liefert diese Studie Statistiken über die Standardorientierung, in die frühe Zebrafischembryonen fallen, wobei der Schwerpunkt auf 70% der Epibolie- und Knospenstadien liegt. Anschließend wird die optimale Anzahl von Ansichten diskutiert, die für die Abbildung von Embryonen im Frühstadium mit zellulärer Auflösung erforderlich sind, und der Fusionsprozess mit BigStitcher, einem auf den Philippinen basierenden Plugin 10,17,18, detailliert beschrieben. Zusammen zielt dieses Protokoll, das ein 20x/1 NA-Objektiv verwendet, darauf ab, Zebrafischembryologen die Verwendung von Multiview-Lichtblattsystemen für die Bildgebung von Embryonen mit Zellkernen und Membranmarkern von der Gastrulation bis zu den frühen Somitenstadien zu erleichtern.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Erhaltungs- und Versuchsverfahren für Zebrafische wurden von der institutionellen Tierethikkommission unter den Aktenzeichen TIFR/IAEC/2023-1 und TIFR/IAEC/2023-5 genehmigt. Embryonen, die durch Kreuzung heterozygoter Fische gewonnen wurden, die Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ exprimieren, wurden im Einzelzellstadium mit H2A-mCherry-mRNA (30 pg) injiziert. Die H2A-mCherry-mRNA wurde mit dem pCS2+ H2A-mCherry-Plasmid (ein Geschenk des Labors von Oates, EPFL) durch in vitro-Transkription synthetisiert. Embryonen, die beide Marker exprimierten, die im Rest des Protokolls als Utr-GFP bzw. H2A-mCherry bezeichnet werden, wurden im 70%-Epibolie- und Knospenstadium abgebildet. Die Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenvorbereitung für die Multiview-Bildgebung

1. Vorbereitung von FEP/PTFE-Schläuchen
   1. Reinigen Sie FEP/PTFE-Schläuche gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren¹⁴.
   2. Schneiden Sie die Röhrchen nach der Reinigung je nach Bedarf in Längen von 2-2,5 cm und lagern Sie sie in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit doppelt destilliertem Wasser. Die Röhrchen können auf diese Weise etwa einen Monat lang gelagert werden.
   3. Erhitzen Sie die Röhrchen vor der Probenvorbereitung ca. 25 Minuten lang auf 70-75 °C, um die Röhrchen zu begradigen. Vermeiden Sie eine Überfüllung in jedem Mikrozentrifugenröhrchen, um ein Verklumpen zu verhindern und ausreichend Platz für eine effektive Röhrchenbegradigung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Tragen Sie während der gesamten Handhabung des Röhrchens Handschuhe, da Fingerabdrücke/Staubpartikel auf den Röhrchen die Bildgebung beeinträchtigen können.
2. Zubereitung von Agarose
   1. Bereiten Sie die E3-Puffer 50x Stammlösungen wie folgt vor:
      1. Stamm 1 - 3,252 g Na₂HPO₄, 0,285 g KH₂PO₄, 11,933 g NaCl, 0,477 g KCl in 1 l entionisiertem Wasser
      2. Stamm 2 - 2,426 g CaCl₂, 4,067 g MgSO₄ in 1 L deionisiertem Wasser.
   2. Um 1x E3-Puffer herzustellen, fügen Sie jeweils 20 mL Lösungen aus Stamm 1 und 2 in 960 mL deionisiertem Wasser hinzu.
      HINWEIS: Geben Sie kein Methylenblau in den E3-Puffer, der für die Bildgebung verwendet wird, da dies zu Lichtstreuung führt.
   3. Niedrigschmelzende Agarose in 1x E3 durch Erhitzen bei 70-75 °C auf einem Heizblock unter Rühren auflösen, bis die Lösung klar und ohne Klumpen oder Kristalle ist.
   4. Für die Multiview-Bildgebung fügen Sie der Agaroselösung handelsübliche fluoreszierende Kügelchen (siehe Materialtabelle) hinzu, die eine Bildregistrierung während der Analyse ermöglichen. Beschallen Sie die Kügelchen bei Raumtemperatur mit einer Frequenz von 40 kHz für 20-30 min in einem Wasserbad-Ultraschallgerät, um die Kügelchen zu disaggregieren.
   5. Geben Sie nach der Beschallung 1 μl Kügelchen zu 10 ml Agaroselösung in ein 15 ml-Röhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen gut durch, um eine gleichmäßige Dispersion der Kügelchen zu gewährleisten.
      HINWEIS: Das Volumen der Bead-Lösung, die der Agarose zugesetzt werden soll, hängt von der Stammlösung und dem Hersteller ab. Probieren Sie eine Reihe von Volumina aus und wählen Sie eine Konzentration, bei der die Kügelchen gut dispergiert erscheinen, wenn sie im Lichtblattsystem abgebildet werden. Zu viele Kügelchen können sich trotz Beschallung und Wirbelbildung ansammeln, während zu wenige Kügelchen die Bildregistrierung beeinträchtigen können.
   6. Bewahren Sie das Agaroseröhrchen mit den zugesetzten Kügelchen mindestens 30 Minuten lang in einem geschlossenen Wasserbad bei 37 °C auf, bevor Sie die Probe vorbereiten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Temperatur der Agarose von 70 °C auf 37 °C gesenkt wird.
3. Probenvorbereitung
   1. Setzen Sie die Fische am Abend vor dem Tag der Bildgebung paarweise mit Trennwänden auf. Entfernen Sie die Trennwände für ca. 15 Minuten und entnehmen Sie die Embryonen mit dem Standardverfahren²⁰.
   2. Sobald die Embryonen das Stadium erreicht haben, das für die Probenvorbereitung von Interesse ist, gießen Sie die gesamten 10 ml Agarose (mit Kügelchen), die bei 37 °C aufbewahrt werden, auf eine 6 cm große Petrischale.
   3. Warten Sie etwa 2-3 Minuten, um die Temperatur unter 33 °C zu bringen, bevor Sie 10 bis 15 Embryonen in die Agaroselösung übertragen.
      HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt, um einen möglichen Hitzeschock für Embryonen zu verhindern, die auf die Agarose übertragen wurden.
   4. Stellen Sie sicher, dass der Agaroselösung während des Embryotransfers so wenig E3-Puffer wie möglich zugesetzt wird. Schwenken Sie die Petrischale so, dass der kleine Puffer, der übertragen worden wäre, gut verteilt wird.
   5. Tragen Sie für den Rest der Probenvorbereitung Handschuhe.
   6. Nehmen Sie eine 200-μl-Mikropipette mit einer geeigneten Pipettenspitze und führen Sie ein gereinigtes gerades Röhrchen, das aus dem Mikrozentrifugenröhrchen entnommen wurde, in die Pipettenspitze ein, wie in Abbildung 1A,B gezeigt.
   7. Aspirieren Sie etwas Agarose in das Röhrchen, gefolgt von 2-3 Embryonen mit der Mikropipette (Abbildung 1C,D). Stellen Sie sicher, dass sich die Embryonen in der Nähe des Bodens der Röhre befinden (Abbildung 1E), was bei der Einrichtung der Bildgebung wichtig wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass zwischen den verschiedenen Embryonen etwas Agarose vorhanden ist (Abbildung 1E), damit die Kügelchen in dieser Region als Registrierungsmarker verwendet werden können.
   8. Lösen Sie das Röhrchen, ohne den Druck von der Pipette zu lösen, von der Pipettenspitze und legen Sie es auf den Deckel der mit E3 gefüllten Petrischale, damit sich die Agarose verfestigen kann (Abbildung 1F).
   9. Die Schritte 1.3.6 bis 1.3.8 werden wiederholt, bis alle Embryonen in der Petrischale in die Röhrchen überführt sind.
   10. Sobald die Agarose erstarrt ist (was 5-10 Minuten dauern kann und durch Überprüfen der Agarose in der Petrischale bestätigt werden kann), übertragen Sie die Röhrchen in ein mit E3 gefülltes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Abbildung 1G).
   11. Lagern Sie die Eileiter mit den Embryonen je nach Bedarf in einem 28 °C oder 33 °C heißen Inkubator, bevor Sie mit der Multiview-Bildgebung fortfahren.

2. Multiview-Bildgebung

HINWEIS: In diesem Schritt wird ein allgemeines Verfahren für die Multiview-Bildgebung von Zebrafischembryonen in den frühen Entwicklungsstadien vorgestellt. Die unten beschriebene Methode kann leicht an jedes Multiview-Lichtblattmikroskopiesystem angepasst werden.

1. Lokalisierung des Embryos
   HINWEIS: Füllen Sie die Probenkammer des Mikroskops mit dem Embryomedium²⁰ und stellen Sie die Temperatur der Probenkammer mindestens 10 Minuten vor der Bildgebung auf die interessierende Temperatur ein.
   1. Der Probenhalter ist wie zuvor beschrieben²¹ zu montieren, jedoch mit einer Änderung. Da die Bildgebung durch die Röhre erfolgt, führen Sie die Röhre mit den Embryonen direkt in eine Kapillare mit dem richtigen Durchmesser ein, so dass sie an Ort und Stelle bleibt, ohne die Agarose herauszudrücken und die Embryonen am Boden zu stören (Abbildung 1H).
      HINWEIS: Da die Probenkammer eine definierte Höhe hat, würde die Sicherstellung, dass sich die Embryonen während der Probenvorbereitung am Boden des Röhrchens befinden (wie in Schritt 1.3.7 erwähnt), eine Positionierung des Embryos im Sichtfeld ermöglichen, ohne den Boden der Kammer zu berühren.
   2. Setzen Sie den Probenhalter in das Multiview-System ein und bringen Sie den Embryo mit den x- und y-Reglern in die Mitte des Sichtfeldes.
   3. Verwenden Sie dann die z-Steuerung des Probennavigators, um den Embryo in den Fokus zu bringen.
   4. Zu diesem Zeitpunkt ist die Ausrichtung des Embryos innerhalb des Chorions deutlich sichtbar, und wenn sie nicht zufriedenstellend ist, führen Sie eine neue Röhre ein und wählen Sie den Embryo mit einer interessanten Ausrichtung.
2. Ausrichten der Lichtbleche
   1. Sobald der Embryo in Position ist, richten Sie alle experimentellen Einstellungen ein - Laser, Strahlengang, Filter, Strahlteiler und Kamera.
   2. Wenn die Software beim Einrichten der Erfassungsparameter eine Option für den Pivot-Scan bereitstellt, wählen Sie diese aus. Ein Pivot-Scan reduziert den Schatteneffekt, der vom Lichtblatt ausgeht, wenn es auf Strukturen oder undurchsichtige Bereiche in der Probe trifft.
   3. Starten Sie das Live-Scannen der Probe. Stellen Sie die Bitgröße, die Laserleistung und den gewünschten Zoom ein, die die Dicke des Lichtblatts und damit die axiale Auflösung bestimmen.
   4. Um die Lichtblätter auszurichten, wechseln Sie zunächst auf einseitige Beleuchtung und ändern Sie nacheinander die Einstellungen der beiden Lichtblätter (links und rechts). Zoomen Sie digital in einen Bereich der Probe, in dem klare Strukturen sichtbar sind.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde entweder ein nukleärer (H2A-mCherry) oder ein Membranmarker (Utr-GFP) verwendet, um die Blätter auszurichten. Es wird empfohlen, die Einstellungen des Lichtblatts in der Software zu ändern, damit der schärfste Signalkontrast im interessierenden Bereich erreicht wird.
   5. Sobald die beiden Leuchtfolien individuell optimiert sind, um das beste Signal zu erzielen, schalten Sie beide Lichtfolien ein. Führen Sie eine zweite Ausrichtungsrunde durch, und stellen Sie sicher, dass das Flackern minimal ist, was auf eine recht gute Ausrichtung der beiden Blätter hinweist.
   6. Sobald die Ausrichtung abgeschlossen ist, aktivieren Sie die Option zum automatischen Zusammenführen der von den beiden Blättern erzeugten Bilder, sofern die Software dies zulässt. Alternativ kann man die Lichtblätter zunächst grob ausrichten, indem man sich auf Perlen um die Probe herum konzentriert, und dann die Ausrichtung anhand von Informationen aus der Probe feinabstimmen.
      HINWEIS: Bei der Bildgebung mit zwei Fluorophoren (z. B. Kern- und Membranmarkern) unterscheidet sich die optimale Ausrichtung für die beiden Strukturen in der Regel geringfügig. Wählen Sie in diesem Szenario eine Einstellung aus, die auf Einschränkungen für die Downstreamverarbeitung basiert. Sollen beispielsweise Zellgrenzen segmentiert werden, was relativ prozessintensiver ist, richten Sie die Lichtschichten anhand des Membranmarkers aus.
3. Einrichten von Multiview-Imaging
   1. Aktivieren Sie nach dem Ausrichten der Lichtfolien die Optionen zum Ausführen eines Z-Stapels sowie einer Multiview-Bildgebung.
   2. Starten Sie das Live-Scannen und navigieren Sie mit dem Probennavigator, um die erste Ansicht auszuwählen. Richten Sie in dieser Ansicht das Slice-Intervall ein, gefolgt vom ersten und letzten Slice des Z-Stapels. Fügen Sie diese Position im Dialogfeld "Mehrfachansicht" hinzu, in dem die Positions- und Z-Stapel-Informationen für diese Ansicht notiert werden.
   3. Wechseln Sie zur nächsten Ansicht, indem Sie den Winkel im Proben-Navigator ändern. Richten Sie den Z-Stapel für die zweite Ansicht ein, und fügen Sie die Informationen im Dialogfeld für die Mehrfachansicht hinzu.
   4. Wiederholen Sie dies für weitere Ansichten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass in jeder Ansicht eine bestimmte Mindestanzahl von Segmenten abgebildet wird, damit genügend Überlappung zwischen den verschiedenen Ansichten vorhanden ist, was schließlich bei der Registrierung der Ansichten während der Verarbeitung hilfreich ist. Die minimale Anzahl der Slices hängt sowohl vom Zoomfaktor als auch von der Anzahl der für die Bildgebung gewählten Winkel ab.
   5. Nachdem Sie alle Ansichten eingestellt haben, speichern Sie diese Informationen in einer Textdatei (z. B. mit dem Namen "embryo-positions"), die z-Stapel-Informationen, (x, y, z), die Koordinaten der Röhre sowie die Angabe des Winkels für jede Ansicht enthält. Löschen Sie nach dem Speichern alle Positionen aus dem Multiview-Dialogfeld.
   6. Da die Bildgebung mit einem intakten Chorion erfolgt, das relativ groß ist, ist es nicht möglich, die Kügelchen in der Röhre mit den gleichen Einstellungen zu betrachten. Daher müssen die Raupeninformationen von einer anderen Position im Rohr aus erfasst werden. Um dies zu tun, übersetzen Sie in eine andere "y"-Koordinate weg vom Embryo, wo die Kügelchen sichtbar sind. Fügen Sie diese Position zum Multiview-Dialogfeld hinzu und speichern Sie diese Position in einer Textdatei (z. B. mit dem Namen "beads-y").
      HINWEIS: Bilden Sie die Kügelchen so nah wie möglich an der Embryoprobe ab, um die Auswirkungen möglicher Unterschiede in der Eileiterkrümmung an den beiden Positionen zu minimieren. Wenn mehrere Embryonen in die Röhre eingesetzt werden, ist es daher wichtig, ein wenig Agarose zwischen den Röhren zu lassen, um die Kügelchen abzubilden (wie in Schritt 1.3.7 erwähnt).
   7. Gehen Sie in den Ordner, in dem die Textdateien gespeichert sind, und duplizieren Sie die Datei 'embryo-positions' in eine neue Datei mit dem Namen 'beads-positions'. Ersetzen Sie die y-Koordinate für alle Ansichten in der Datei 'beads-positions' durch die y-Koordinate aus der Datei 'beads-y'. Dadurch wird sichergestellt, dass die Perlen mit der gleichen Anzahl von Ansichten, Z-Stapeln und X-Koordinaten, aber an einer anderen Y-Position in der Röhre abgebildet werden.
   8. Kehren Sie zur Bildgebungssoftware zurück und laden Sie die Datei "bead-positions" in die Software. Wenn die Option Zeitreihen aktiviert ist, wählen Sie einen Zyklus aus und starten Sie das Experiment. Speichern Sie Raupenbilder als "Perlen", die für die Registrierung der verschiedenen Ansichten während der Bildverarbeitung verwendet werden.
   9. Nachdem Sie die Perlenbilder aufgenommen haben, löschen Sie die Positionen und laden Sie die anfängliche Datei "embryo-positions" in die Software. Stellen Sie die gewünschte Anzahl von Zyklen mit einem geeigneten Zeitintervall ein und starten Sie das Experiment.

3. Multiview-Bildanalyse

HINWEIS: Für die Verschmelzung der Multiview-Bilder wird ein FIJI-Plugin, BigStitcher, verwendet, die neueste Version des Multiview-Rekonstruktions-Plugins, 10,17,18. Das Plugin kann installiert werden, indem das BigStitcher-Plugin in der Funktion "Update-Sites verwalten" hinzugefügt wird, die über die Option "Update" im Menü "Hilfe" aufgerufen werden kann. Nach der Installation wird das Plugin im Menü "Plugins" angezeigt. Die groben Schritte bei der Fusion sind wie folgt: (1) Definieren Sie .xml/.h5-Dateipaare sowohl für die Kügelchen als auch für die Embryonen; (2) Registrieren Sie alle Ansichten in der Perlendatei; (3) Extraktionspunkt-Spreizfunktion (PSF) für die Kügelchen, die zur Dekonvolution verwendet werden kann (Abbildung 2A); (4) Übertragen Sie die Registrierungs- und PSF-Informationen aus der Kügelchendatei in die Embryodatei und beginnen Sie mit der Multiview-Dekonvolution. Die meisten dieser Schritte wurden bereits ausführlich^{beschrieben 21}, und hier werden die Schritte beschrieben, die unterschiedlich verarbeitet werden.

1. Definieren eines .xml Datensatzes
   1. Definieren Sie einen neuen Datensatz sowohl für die Kügelchen als auch für den Embryo als "beads.xml" bzw. "embryo.xml", wie zuvor beschrieben²¹.
2. Erkennung und Registrierung anhand von Interessenpunkten
   1. Nach dem erfolgreichen Export der beads.xml Datei wählen Sie im Dialogfeld "Multiview Explorer" die Ansichten aus, die für die Registrierung erforderlich sind (Abbildung 2B). Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Interessenpunkte erkennen aus. Fahren Sie mit den Schritten wie beschrieben^{fort 21}.
   2. Nachdem Sie Interessenpunkte erkannt haben, wählen Sie alle Ansichten aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Mit Interessenpunkten registrieren aus. Befolgen Sie das Protokoll wie beschrieben²¹.
   3. Überprüfen Sie sorgfältig, ob die Perlenregistrierung erfolgreich funktioniert hat. Nach erfolgreicher Registrierung werden überlappende Perlen aus verschiedenen Ansichten überlagert (Abbildung 2C). Um zu überprüfen, wie genau die Registrierung funktioniert hat, wählen Sie zwei aufeinanderfolgende Ansichten aus, wechseln Sie zum überlappenden Bereich und wechseln Sie zwischen den beiden Ansichten, um zu beobachten, ob sich die aus verschiedenen Winkeln abgebildeten Perlen überlagern. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede nachfolgende Ansicht.
   4. Wenn die Überlappung nicht genau ist, wiederholen Sie die Registrierung, indem Sie die erforderliche Signifikanz für die Registrierung und/oder den akzeptablen Überlappungsfehler (im Dialogfeld "Registrierung" als "RANSAC-Fehler" bezeichnet) lockern.
   5. Klicken Sie nach erfolgreicher Registrierung im Fenster "Multiview Explorer" auf Speichern , um die aktualisierte .xml Datei zu speichern.
      HINWEIS: Speichern Sie auch die Protokolldatei, da sie weitere detaillierte Informationen über die Effizienz der Registrierung enthält. Um die Registrierungsinformationen von den Kügelchen in den Embryo zu übertragen, befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.
   6. Öffnen Sie die bead.xml Datei in einem Texteditor Ihrer Wahl und kopieren Sie den gesamten Block unter "ViewRegistrations".
   7. Öffnen Sie die embryo.xml und ersetzen Sie den Block "ViewRegistrations" durch den Block, der aus der Beads-Datei kopiert wurde. Wenn mehrere Kanäle vorhanden sind, ersetzen Sie die Registrierungsinformationen für jeden Kanal wie oben. Die Registrierungsinformationen können entweder manuell oder mit dem eigens geschriebenen MATLAB-Code übertragen werden, der hier heruntergeladen werden kann: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. Öffnen Sie die embryo.xml Datei in "BigStitcher" und prüfen Sie sorgfältig, ob die Registrierung für den Embryo erfolgreich funktioniert hat. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang wie für die Perlen, indem Sie die Überlappung der interessierenden Strukturen in jeweils zwei aufeinanderfolgenden Ansichten überprüfen.
      HINWEIS: Gelegentlich kann es vorkommen, dass die Registrierung des Embryos nicht so wünschenswert ist, obwohl die Kügelchen perfekt registriert wurden. Dies ist möglich, wenn sich die Krümmung der Röhre von der Position, an der die Kügelchen abgebildet werden, zur Embryonalposition geringfügig ändert. Darüber hinaus kann es zu subtilen Bewegungen des Embryos zwischen den Ansichten kommen, da er frei im Chorion schwebt. In diesem Fall führen Sie eine zweite Registrierungsrunde mit einem Kernmarker im Embryo durch.
   9. Öffnen Sie dazu die embryo.xml Datei in "BigStitcher", klicken Sie mit der rechten Maustaste auf alle Ansichten, die den Kernmarker haben, und wählen Sie Interessenpunkte erkennen.
   10. Benennen Sie die Interessenpunkte in "Kerne" um und fahren Sie mit den Schritten fort, die für Kügelchen ausgeführt wurden.
   11. Stellen Sie beim Einstellen der Parameter "Differenz der Gauß" sicher, dass die meisten, wenn nicht sogar alle Kerne nachgewiesen werden und dass kein ektopischer Kernnachweis erfolgt. Klicken Sie anschließend auf Fertig.
   12. Registrieren Sie anschließend diese Ansichten, indem Sie Mit Zinspunkten registrieren wählen und sich für die Option Präziser Deskriptor basiert (translationsinvariant) entscheiden. Stellen Sie sicher, dass die Option "Alle Ansichten und Interessenpunkte vergleichen" ausgewählt ist, und verwenden Sie "Kerne" als Interessenpunkte. Verwenden Sie die Option zum Fixieren der ersten Ansicht und zum Zuordnen nicht zurück.
   13. Verwenden Sie für die Registrierung ein affines Modell mit starrer Regularisierung und den Standardparametern im Plugin.
   14. Überprüfen Sie den Erfolg der Registrierung erneut, indem Sie alle zwei aufeinanderfolgenden Ansichten vergleichen.
   15. Klicken Sie nach erfolgreicher Registrierung im Fenster "Multiview Explorer" auf Speichern , um die aktualisierte .xml Datei zu speichern.
   16. Öffnen Sie die embryo.xml Datei in einem Texteditor Ihrer Wahl und kopieren Sie die Registrierungsinformationen von den nuklearen Markern auf die anderen Kanäle.
3. Extraktion und Zuweisung von Punktspreizungsfunktionen
   1. Um eine Multiview-Dekonvolution durchzuführen, extrahieren Sie die PSF des Bildgebungssystems aus dem registrierten Kügelchendatensatz und wenden Sie sie auf die Embryodatei an.
   2. Um diese Informationen zu erhalten, wählen Sie alle Ansichten in der Bead-Datei aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Optionen Punktverteilungsfunktionen und Extraktion aus.
   3. Stellen Sie im angezeigten Dialogfeld sicher, dass die Optionen "Entsprechende Interessenpunkte verwenden " und "Min. Intensitätsprojektionen aus PSF entfernen " aktiviert sind, fahren Sie mit den Standard-PSF-Größen fort und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Wenn die PSF-Extraktion für alle Ansichten erfolgreich ist, wird in der Protokolldatei "Extrahierte n/n PSFs" angezeigt.
   4. Speichern Sie anschließend die .xml Datei erneut. Ein aktiviertes Kontrollkästchen in der PSF-Spalte des Dialogfelds "Multiview Explorer" wird angezeigt, und ein "psf"-Ordner wird in dem entsprechenden Ordner mit allen extrahierten PSFs generiert.
   5. Öffnen Sie die embryo.xml Datei und weisen Sie die PSF für jede Ansicht separat zu. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf "eine Ansicht" → klicken Sie auf Punktspreizungsfunktionen → wählen Sie Zuweisen → wählen Sie Erweitert, gefolgt von Neue PSF allen ausgewählten Ansichten zuweisen. Klicken Sie auf Durchsuchen, gehen Sie zum .xml Dateipfad und öffnen Sie den PSF-Ordner .
   6. Wählen Sie die passende PSF mit der entsprechenden ID in der ausgewählten Ansicht aus und klicken Sie auf OK, woraufhin das PSF-Kontrollkästchen im Fenster "Multiview Explorer" aktiviert erscheint.
   7. Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Ansichten.
4. Multiview-Fusion und -Dekonvolution
   1. Nachdem die Punktverteilungsfunktion für alle Ansichten zugewiesen wurde, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Multiview-Entfaltung.
   2. Wählen Sie den Begrenzungsrahmen als aktuell ausgewählte Ansichten aus. Für diese Arbeit funktionieren die standardmäßige OSEM-Beschleunigung und die Anzahl der Iterationen gut.
   3. Führen Sie bei Bedarf ein Downsampling der Bilder durch, wenn eine schnellere Berechnung gewünscht wird oder wenn der CPU-Speicher begrenzt ist.
      HINWEIS: Wenn der erforderliche Arbeitsspeicher den vorhandenen Speicher übersteigt, wird am unteren Rand des Fensters eine Warnmeldung in roter Farbe angezeigt. Starten Sie die Dekonvolution nicht, wenn diese Warnung erscheint, da das Plugin irgendwann während der Verarbeitung ins Stocken gerät und nicht mehr reagiert.
   4. Um den Fortschritt der Dekonvolution zu beurteilen, überprüfen Sie die Protokolldatei, in der alle 5 Iterationen Ergebnisse angezeigt werden.
   5. Um die Rechengeschwindigkeit zu erhöhen, führen Sie eine Multiview-Dekonvolution in der GPU durch, falls zuvor installiert.
      HINWEIS: Am Ende dieses Vorgangs öffnet sich ein verschmolzenes Bildfenster, das als TIFF-Datei gespeichert werden kann.

Ergebnisse

Die präzise Ausrichtung der Probe ist ein wesentlicher Bestandteil der effizienten Nutzung eines Mikroskopie-Setups. Bei der Verwendung eines Multiview-Lichtplattensystems ist das manuelle Ausrichten der Proben jedoch oft nicht möglich, da die Proben in einem Röhrchen vorbereitet werden müssen. Um zu überprüfen, ob es stereotype Positionen gibt, die Embryonen innerhalb des Chorions einnehmen, wurden Zebrafischembryonen mit 70% Epibolie (etwa 7 h nach der Befruchtung (hpf)) abgebild...

Diskussion

Die Positionierung eines Embryos in der richtigen Ausrichtung, um die interessierende Region abzubilden, ist einer der geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte, der oft zu einer fehlgeschlagenen Mikroskopiesitzung für eine Anwenderin führt. Dies gilt umso mehr für ein Multiview-Lichtblattmikroskop, bei dem die manuelle Manipulation der Ausrichtung schwierig ist, da die Proben in eine Röhre eingebettet sind. Um diesen Prozess zu unterstützen, berichtet diese Studie über die Statistik v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss