Messung des Kohlenstoffgehalts in Makrophagen der Atemwege, die kohlenstoffhaltigen Partikeln ausgesetzt sind

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes experimentelles Protokoll zur Messung des Kohlenstoffgehalts von Atemwegsmakrophagen mit dem Ziel, die interne Expositionsdosis auf der Ebene der individuellen Feinstaubexposition zu bewerten.

Zusammenfassung

Lungenmakrophagen zeigen ein dosisabhängiges Muster bei phagozytierenden Partikeln. Nach dem Verschlingen werden diese Makrophagen anschließend mit dem Sputum ausgeschieden, wodurch Makrophagen und Partikel lichtmikroskopisch sichtbar und quantifizierbar werden. Bemerkenswert ist, dass elementarer Kohlenstoff im Körper von Säugetieren ausschließlich aus externen Verunreinigungen stammt. Folglich dient der Kohlenstoffgehalt in Atemwegsmakrophagen (CCAM) als valider Expositions-Biomarker, der die individuelle Exposition gegenüber kohlenstoffhaltigem Feinstaub (PM) genau abschätzt. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das die Sputumsammlung, Konservierung, Verarbeitung, Vorbereitung und Färbung von Sputum sowie die Erfassung und Analyse von Makrophagenfotos umfasst. Nach der Entnahme der Makrophagenkerne wurde der Anteil der von Kohlenstoffpartikeln (PCOC) eingenommenen Zytoplasmafläche berechnet, um den Kohlenstoffgehalt in jedem Makrophagen zu quantifizieren. Die Ergebnisse deuten auf einen Anstieg der CCAM-Werte nach Exposition gegenüber kohlenstoffhaltigem PM hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese nicht-invasive, präzise, zuverlässige und standardisierte Methode die direkte Messung von Kohlenstoffpartikeln in Zielzellen ermöglicht und für die großflächige Quantifizierung einzelner CCAM durch induziertes Sputum verwendet wird.

Einleitung

Die Luftverschmutzung wird mit Todesfällen aufgrund von Atemwegs- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht und stellt eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar ^1,2. Epidemiologische Daten deuten darauf hin, dass die chronische Exposition gegenüber Feinstaub mit einem Durchmesser von mindestens 2,5 μm (PM2,5) für den vorzeitigen Tod von 4 bis 9 Millionen Menschen weltweit verantwortlich ist. PM2,5 wurde in der Global Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study (GBD) 2015 als fünftwichtigster Risikofaktor für die weltweite Sterblichkeit eingestuft3,4,5,6. Studien haben ergeben, dass die Einhaltung der WHO-Richtlinien zur Luftverschmutzung 51.213 Todesfälle pro Jahr durch PM2,5-Exposition verhindern könnte³. Derzeit fehlt in den meisten Studien die Bewertung der intraindividuellen Exposition und sie basieren nur auf groben Auswertungen an größeren regionalen Messstellen, die weit von den individuellen Expositionswerten entfernt sind. Die verfügbaren Biomarker für die interne Exposition, wie z. B. PAK im Urin und Benzo(a)pyren, spiegeln nicht den Zusammenhang zwischen Feinstaubexposition und gesundheitlichen Auswirkungen wider ^7,8,9. Dies führt dazu, dass es nicht möglich ist, einen genauen Zusammenhang mit den gesundheitlichen Auswirkungen herzustellen. Daher ist die Suche nach Markern, die das Ausmaß der Feinstaubbelastung einer Person widerspiegeln, einer der Schlüssel zu einer genauen Expositionsabschätzung für Einzelpersonen.

Partikel, die in die Bronchien eingeatmet werden, können durch Ziliarrschwingungen in den Bronchien mit dem Auswurf ausgeschieden werden. Das Fehlen eines flimmernden Schleimflusstransportsystems in den Lungenbläschen bedeutet, dass der primäre Clearance-Weg für Partikel, die in die Lungenbläschen gelangen, über Phagozytose und Translokation durch Makrophagen erfolgt^10,11. Aufgrund der anatomischen Struktur der Lunge ist die Beseitigung von unlöslichen partikulären Fremdstoffen langsam. Dies ermöglicht es Feinstaub, über längere Zeiträume mit Lungenzellen zu interagieren und verschiedene biologische Wirkungen auszulösen, die das Lungengewebe und andere Organe schädigen ^12,13. Die Stimulation durch Feinstaub führt zur Aktivierung von Makrophagen und löst eine Kaskade von Entzündungsfaktoren in der Lunge aus, die eine systemische Entzündungsreaktion auslösen können¹⁴. In Anbetracht der entscheidenden Rolle der Makrophagen-Zytophagie bei der Auslösung von Zytokinstürmen in der Lunge wird die Theorie aufgestellt, dass Kohlenstoffpartikel aus Lungenmakrophagen die biologisch wirksame Dosis der Exposition gegenüber kohlenstoffnukleierten Partikeln in der Luft widerspiegeln könnten¹⁵. Da es in Säugetierzellen keine Aggregation von elementarem Kohlenstoff gibt und kohlenstoffhaltige Partikel als schwarzer Feinstaub unter einem Lichtmikroskop beobachtet werden können, kann die Entnahme von Alveolarm- und Bronchialmakrophagen und die Messung des Kohlenstoffgehalts in ihnen als Marker für die Bewertung der Feinstaubexposition dienen¹⁶.

In dieser Studie wurde eine Methode zur genauen Bewertung der individuellen Feinstaubbelastung identifiziert, die als Kohlenstoffgehalt von Atemwegsmakrophagen (CCAM) bekannt ist. Konkret wurden Sputumproben der Bevölkerung entnommen, nachdem die Teilnehmer hypertone Kochsalzlösung inhaliert hatten, die von einem Ultraschallvernebler erzeugt wurde. Diese Proben wurden dann mit einer Fixierlösung konserviert. Makrophagen der Atemwege wurden isoliert, gefärbt und unter einem Lichtmikroskop fotografiert, um Makrophagen mit kohlenstoffhaltigen Partikeln zu identifizieren, die dann quantifiziert wurden. Diese Methode bietet einen biologischen Marker für die genaue Bewertung der individuellen Feinstaubbelastung. Es schafft eine methodische Grundlage für die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Feinstaubbelastung und gesundheitlichen Auswirkungen und dient als Forschungsgrundlage für die Erforschung von Zusammenhängen zwischen Feinstaubexposition und gesundheitlichen Folgen wie Lungenerkrankungen.

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Protokoll

Die Studie erhielt die Genehmigung der medizinischen Ethikkommission des Instituts für Arbeitsmedizin und Giftkontrolle des chinesischen Zentrums für Krankheitskontrolle und -prävention (NIOHP201604), wobei die schriftliche Einverständniserklärung aller Probanden vor der Studie und der Entnahme biologischer Proben eingeholt wurde. Für diese Studie wurden Rußverpacker ausgewählt, die seit mehr als 1 Jahr in einer Rußfabrik arbeiteten und Rußaerosolen ausgesetzt waren. Für die Durchführung der Studie wurden Wasserwerksarbeiter in einer Wasserwerksfabrik ohne nennenswerte berufliche Exposition gegenüber schädlichen Faktoren aus der Umgebung als Kontrollpopulation rekrutiert. Für die Studienpopulation wurden folgende Ein- und Ausschlusskriterien ausgewählt: Einschlusskriterien für Rußverpacker waren der direkte Kontakt mit Ruß während der meisten Schichten und eine mindestens einjährige Arbeit im Bereich der Rußexposition. Beschäftigte in Wasserwerken wurden einbezogen, wenn sie in ihrem Arbeitsumfeld nicht beruflich Ruß oder anderen Schadstoffen ausgesetzt waren. Zu den Ausschlusskriterien gehörten Arbeitnehmer mit chronischen Krankheiten wie Krebs, Personen, die in den letzten drei Monaten einer Röntgenstrahlenexposition unterzogen worden waren, Personen mit Lungentuberkulose in der Vorgeschichte, Lungenchirurgie, viraler Myokarditis, angeborenen Herzfehlern, kürzlichem Fieber oder Entzündungen sowie Arbeitnehmer, die kürzlich Antibiotika eingenommen hatten. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Konservierung von Sputum

1. Bereiten Sie die Fixierlösung vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
   1. 2% Polyethylenglykol (PEG1500) in einem Wasserbad schmelzen. Nehmen Sie 20 ml geschmolzenes PEG1500 in ein Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 20 ml 50%iges Ethanol in das Zentrifugenröhrchen und schütteln Sie die Mischung gründlich, um die Mutterlauge herzustellen.
   2. Gießen Sie nach und nach 40 mL der Mutterlauge in 960 mL 50%iges Ethanol. Schütteln Sie die Lösung gut, um die Saccomanno-Fixierlösung zu bilden. Bewahre die Lösung an einem kühlen, dunklen Ort auf.
2. Geben Sie 20-30 ml der vorbereiteten Fixierlösung in ein Zentrifugenröhrchen mit ca. 2 ml Sputum. Mischen Sie den Inhalt gründlich.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 40 ml nicht überschreitet.
3. Verschließen Sie das Zentrifugenröhrchen mit einer Siegelfolie. Bewahren Sie es an einem kühlen, dunklen Ort auf. Transportieren Sie das Röhrchen zur weiteren Verarbeitung ins Labor, wenn es fertig ist.
   HINWEIS: Schmelzen Sie PEG1500 immer im Wasserbad und verwenden Sie es gemäß der vorgeschriebenen Dosierung.

2. Herstellung der Zellsuspension im Sputum

1. Bereiten Sie die Verdauungslösung vor, indem Sie 0,1 g Dithiothreitol in 100 ml Kochsalzlösung gemäß der tatsächlichen Dosierung auflösen. Die vorbereitete Lösung bis zu 48 h bei 4 °C lagern.
2. Das Röhrchen mit dem Auswurf bei 1.998 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
3. Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie dem Niederschlag das gleiche Volumen an Sputumverdau. Die Mischung aufreiben und gründlich schütteln.
   1. Stellen Sie das Rohr bis zur vollständigen Verflüssigung (10-15 min) in ein 37 °C heißes Wasserbad.
      HINWEIS: Schütteln Sie das Röhrchen während des Verflüssigungsprozesses kontinuierlich.
4. Das verflüssigte Gemisch mit einer 70 μm Filtermembran filtrieren.
5. Die filtrierte Lösung wird bei 500 x g 7 min bei 4 °C zentrifugiert.
6. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie den Zellausfall bei.
7. Den Zellniederschlag in Duchennephosphatpuffer resuspendieren. Die resuspendierte Lösung wird bei 500 x g für 7 min bei 4 °C zentrifugiert, um einen reinen Zellniederschlag zu erhalten.

3. Vorbereitung des Zellabstrichs

1. Geben Sie 200-600 μl Phosphatpuffer in das Zellsediment. Mischen Sie den Inhalt gründlich; Passen Sie das Puffervolumen basierend auf den Ergebnissen der Zellzählung an (streben Sie >1,0 × 10⁵ Zellen an).
2. Nehmen Sie 20 μl der Zellsuspension und erstellen Sie einen Zellabstrich nach der Hämatokritmethode¹⁷.
3. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen (innerhalb von 48 h). Fixieren Sie den Abstrich 10 s lang mit einer handelsüblichen Färbelösung.
4. Tauchen Sie den Abstrich 8 s lang in eine Färbelösung. Heben Sie den Objektträger während des Färbens vorsichtig auf und ab und spülen Sie überschüssigen Fleck mit fließendem Wasser ab.
5. Färben Sie den Abstrich 8 s lang in B-Färbelösung. Heben Sie den Objektträger während des Färbens an und spülen Sie überschüssigen Fleck unter fließendem Wasser ab.
   HINWEIS: Die Färbelösungen A und B sind im handelsüblichen Färbeset erhältlich.
6. Tauchen Sie den Objektträger zweimal in wasserfreies Ethanol, jeweils für 2-3 s.
7. Nach dem Trocknen eine angemessene Menge neutrales Kaugummi auftragen. Verschließen Sie die Folie mit Deckgläsern.

4. Quantitative Analyse von CCAM

1. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop mit einem 100-fach Ölobjektiv. Nehmen Sie Bilder von zufällig ausgewählten, gut gefärbten und morphologisch intakten Makrophagen auf. Nehmen Sie für jede Probe 50 Makrophagenbilder nach dem Zufallsprinzip auf.
2. Führen Sie die Bildanalyse in der Image J-Software durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
   1. Messen Sie den Maßstab und bestimmen Sie die tatsächliche Länge und die Pixel-zu-Pixel-Konvertierung (282 Pixel = 10 μm). Stellen Sie den Maßstab in Bild J ein (Analysieren > Maßstab festlegen), geben Sie Entfernung in Pixel, tatsächliche Länge, Längeneinheit (μm) ein und aktivieren Sie Global.
   2. Verwenden Sie eine unregelmäßige Form, um die Zellen zu umranden. Entfernen Sie den Hintergrund (Freihandauswahl, Bearbeiten > Außenseite löschen). Messen Sie die Gesamtfläche der Zellen (Analysieren > Messen).
   3. Schneiden Sie den Kern aus (Bearbeiten > Ausschneiden). Konvertieren Sie das Graustufenbild in Schwarzweiß (Bild > Typ > 8 Bit).
   4. Passen Sie den Graustufenwert an, der für jede Zellfärbung spezifisch ist, um eine genaue Zählung der Kohlenstoffpartikel zu erzielen (Bild > >Anpassen des Schwellenwerts > Anwenden, Analysieren >> Messen).
   5. Berechnen Sie den Kohlenstoffgehalt von 50 Makrophagen pro Probe basierend auf der gemessenen Fläche und der Bildanalyse in der Image J-Software.

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Ergebnisse

Das mit der Fixierlösung konservierte und verarbeitete Sputum zeigte während der morphologischen Untersuchung unter einem Lichtmikroskop eine intakte Makrophagenmorphologie. Die Makrophagen wiesen klare, runde oder nierenförmige, leicht färbbare Zellkerne auf. Nach der Färbung erschienen die Zellkerne bläulich-violett, während das Zytoplasma hellrosa oder hellblau war. Das mikroskopische Feld wies minimale Verunreinigungen auf, was eine einfache Zellidentifizierung ermöglichte. I...

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Diskussion

Diese Studie stellt ein detailliertes experimentelles Protokoll für die Verwendung von induziertem Sputum-abgeleitetem CCAM als biologischen Marker für die interne Exposition gegenüber atmosphärischem Feinstaub vor. CCAM kann durch optische Mikroskopie nachgewiesen und quantifiziert werden und dient als präziser interner Expositionsbiomarker, der den Zusammenhang mit gesundheitlichen Auswirkungen widerspiegelt. Daher besteht die Notwendigkeit, eine komfortable, zuverlässige und eff...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL sterile straws	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	84202ES03
50 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific, USA	339652
Absolute ethyl alcohol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	64-17-5
Cedar oil	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD	C805296
Diff-quick staining solution	Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD	40748ES76
Dithiothreitol	Solebo Bio Co., LTD	D8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)	Thermo Fisher Scientific, USA	14190144
Microscope camera	Olympus Corporation of Japan	DP72
Neutral tree gum	Solebo Bio Co., LTD	G8590
Nylon filter membrane 70um	BD Falcon Bioscience, USA	211755
Optical microscope	Olympus Corporation of Japan	BX60
Polyethylene glycol	Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD	25322-68-3
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	SL40R
Viscous slide	Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD	188105