LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

Zusammenfassung

Der Zelltod ist ein grundlegender Prozess in allen lebenden Organismen. Das Protokoll etabliert eine Lipopolysaccharid (LPS) und Adenosintriphosphat (ATP)-induzierte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)-differenzierte Lipidablagerung im humanen Monozyten (THP-1)-Makrophagenmodell, um den Zelltod zu beobachten. LPS in Kombination mit ATP ist eine klassische Entzündungsindufuhrmethode, die häufig zur Untersuchung von Pyroptose verwendet wird, aber Apoptose und Nekroptose reagieren auch auf die Stimulation durch LPS/ATP. Unter normalen Umständen ist Phosphatidylserin nur im inneren Segel der Plasmamembran lokalisiert. In den frühen Stadien der Pyroptose, Apoptose und Nekroptose bleibt die Zellmembran jedoch intakt und Phosphatidylserin ausgesetzt, und in den späteren Stadien verliert die Zellmembran ihre Integrität. Hier wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Doppelfärbung von Annexin V und 7-Aminoactinomycin D (AAD) zu analysieren, um den Zelltod der gesamten Zellen nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass substanzielle Zellen nach Stimulation mit LPS/ATP abstarben. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie beobachten wir die möglichen Formen des Zelltods in einzelnen Zellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellen nach Stimulation mit LPS/ATP Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose durchlaufen können. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beobachtung des Todes von Makrophagen nach Stimulation mit LPS/ATP. Die Ergebnisse zeigten, dass der Zelltod nach LPS- und ATP-Stimulation nicht auf Pyroptose beschränkt ist und dass auch Apoptose und nekrotische Apoptose auftreten können, was den Forschern hilft, den Zelltod nach LPS- und ATP-Stimulation besser zu verstehen und eine bessere experimentelle Methode zu wählen.

Einleitung

Der Zelltod ist ein grundlegender physiologischer Prozess in allen lebenden Organismen. In den letzten Jahren haben umfangreiche Studien gezeigt, dass der Zelltod an der Immunität und dem Gleichgewicht im Organismus beteiligt ist. Die Erforschung des Zelltods hilft uns, den Ausbruch und die Entwicklung von Krankheiten besser zu verstehen. Es wurden mehrere Formen des programmierten Zelltods beschrieben, und es wurden einige wichtige Ziele in diesen Prozessen identifiziert. Pyroptose, Apoptose und Nekroptose sind die drei genetisch definierten programmierten Zelltodwege, die am inneren Gleichgewicht und an der Krankheit beteiligt sind¹.

Die Pyroptose zeichnet sich durch die Bildung von Membranporen und die Freisetzung von Zellinhalten aus. Aktivierte Caspasen oder Granzyme spalten Gasdermine, um ihre N-terminalen Domänen zu trennen, die dann oligomerisieren, an die Membran binden und Poren bilden ^2,3,4. Die Gasderminpore bietet einen atypischen Sekretionskanal durch die Zellmembranen, was zu nachgeschalteten Zellreaktionen führt, einschließlich der Freisetzung von Inhaltsstoffen und des Ioneneinstroms ^2,3,4. Letztendlich kommt es in den Zellen zu einem Plasmamembranriss und einer pyroptotischen Lyse, die durch Ninjurin-1⁵ erleichtert wird. Bei der Apoptose bilden aktivierte Bax und Bak Oligomere auf der mitochondrialen Außenmembran und setzen Cytochrom C frei, das durch ein Gleichgewicht zwischen proapoptotischen und antiapoptotischen Proteinen der BCL-2-Familie, Initiator-Caspasen (Caspase-8, -9 und -10) und Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6 und -7) reguliert ^wird1,6,7. Zu den morphologischen Veränderungen der Apoptose gehören Membranblasen, Zellschrumpfung, Kernfragmentierung, Chromatinkondensation und apoptotische Körperbildung ^6,8. Die Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Protein-Kinase 1 (RIPK3) und die Mixed-Lineage-Kinase-Domain-like (MLKL) sind zwei nachgeschaltete Kernkomponenten des nekrotischen Mechanismus¹. RIPK3 rekrutiert und phosphoryliert MLKL, p-MLKL oligomerisiert, assoziiert mit der Zellmembran, initiiert Membranperforationen, verursacht Ioneneinstrom, erhöht die intrazelluläre Osmolarität und schließlich Zellruptur ^6,9. Gasdermine und MLKL binden an die Plasmamembran und vermitteln Pyroptose bzw. Nekroptose, während BAX/BAK die Apoptose durch Bindung an die äußere Membran der Mitochondrien vermittelt⁶.

Obwohl jeder Signalweg spezifische Mechanismen und Ergebnisse hat, führen sie zu ähnlichen Veränderungen der Zellmembran. Unter normalen Umständen ist Phosphatidylserin (PS) nur im inneren Segel der Plasmamembran lokalisiert. In den frühen Stadien der Pyroptose, Apoptose und Nekroptose wird PS jedoch außerhalb der Plasmamembran exponiert. Caspase-3/Caspase-7 aktiviert die TMEM16- und XKR-Familien, was zu einer asymmetrischen Zellmembran führt und PS während der Apoptose¹⁰ externalisiert. Der Gasdermin D-vermittelte und MLKL-vermittelte Ca2⁺-Einstrom führt zum Verlust der Symmetrie der Phospholipid-Doppelschicht auf der Zellmembran und zur Exposition von PS. Die Exposition tritt vor dem Verlust der Integrität der Zellmembran^{auf 11,12}. Basierend auf den ähnlichen Veränderungen in der Membran dieser drei Arten des programmierten Zelltods verwenden wir die Durchflusszytometrie, um die Doppelfärbung von Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) zu analysieren und den Zelltod nachzuweisen. Annexin V, ein calciumabhängiges Phospholipid-bindendes Protein, weist eine hohe Affinität zu PS auf, das als empfindliche Sonde zum Nachweis von exponiertem PS auf der Oberfläche der Plasmamembran dienen kann¹³. 7-AAD ist eine Nukleinsäurefärbung, die nicht die gesamte Zellmembran passieren kann. Es ähnelt Propidiumiodid (PI), einem häufig verwendeten Nukleinsäurefarbstoff. Sie haben ähnliche Fluoreszenzeigenschaften, aber 7-AAD hat ein engeres Emissionsspektrum und weniger Interferenzen mit anderen Detektionskanälen. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten reicht es nicht aus, zwischen Pyroptose, Apoptose und Nekroptose zu unterscheiden. Wir haben die Durchflusszytometrie verwendet, um den Zelltod ganzer Zellen nachzuweisen. Mit einer zweiten Methode wird die Zellmembran mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) erfasst, um die möglichen Formen des Zelltods in einzelnen Zellen zu beobachten.

Wir etablierten eine Lipopolysaccharid (LPS) und Adenosintriphosphat (ATP)-induzierte Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)-differenzierte Lipidablagerung in humanen Monozyten (THP-1)-Makrophagenmodellen, um den Zelltod zu beobachten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beobachtung des Zelltods und nicht auf die Untersuchung von Mechanismen.

Protokoll

1. Zelllinie und Zellkultur

1. Die humane monozytäre Zelllinie THP-1 wird in RPMI-1640 vollständigem Kulturmedium mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM β-Mercaptoethanol gezüchtet. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ -befeuchteter Luft. Subkulturzellen alle 2-3 Tage.
   HINWEIS: THP-1 ist eine Suspensionszelle, wählen Sie diese Option, um die Hälfte des Mediums für die Subkultivierung zu wechseln. Bei der Betrachtung vieler Zellfragmente unter dem Lichtmikroskop zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in dem vorgewärmten, frischen vollständigen Zellkulturmedium.
2. Verwenden Sie für alle Experimente Zellen (in den Passagen 4-10) in der logarithmischen Wachstumsphase. Wenn sich die Zellen in einem guten Zustand und in einer logarithmischen Wachstumsphase befinden, sind sie unter dem Lichtmikroskop bei 100 x rund, hell, dicht und ohne Klumpen und Zellfragmente.

2. Differenzierung von THP-1-Zellen

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von PMA mit einer Konzentration von 1 mM vor (lösen Sie 1 mg PMA in 1,62 mL Dimethylsulfoxid). Die PMA-Stammlösung mit vollständigem Zellkulturmedium auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 100 nM verdünnen.
2. Sammeln Sie die Zellen in der Kulturschale in einem sterilen 10-ml-Zentrifugenröhrchen. Bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, Zellen mit 3 mL vollständigem Kulturmedium resuspendieren, das PMA enthält.
3. Öffnen Sie den Zellzähler und die Zählsoftware. Pipettieren Sie 20 μl Zellsuspension auf die Zellzählerplatine und setzen Sie sie in die Zellzählerplatine ein. Klicken Sie auf Vorschau B1, drehen Sie den Knopf unten rechts am Instrument und passen Sie die Brennweite an, um die Zellen mit hellem Zentrum und klaren Konturen in der Software zu erstellen. Klicken Sie auf Zählen , um die Zählung zu starten.
4. Basierend auf den Zählergebnissen verwenden Sie ein vollständiges Kulturmedium, das PMA enthält, um eine Zelldichte auf 1 x 10⁶ Zellen/ml einzustellen. Keimzellen in einer 6-Well-Platte, inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ , bevor Sie mit der weiteren Behandlung beginnen.

3. Behandlung von THP-1-Zellen

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von LPS mit einer Konzentration von 1 mg/ml vor (lösen Sie 1 mg LPS in 1 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)). Die LPS-Stammlösung mit serumfreiem Medium auf eine Endarbeitskonzentration von 1 μg/ml verdünnen. Bereiten Sie eine Stammlösung von Na₂ATP mit einer Konzentration von 500 mM vor (lösen Sie 0,3026 g ATP in 1 mL PBS).
2. Das PMA-haltige Medium aus den Vertiefungen aspirieren und mit PBS 1x waschen. Geben Sie der Kontrollgruppe serumfreies Medium und der Modellgruppe serumfreies Medium mit LPS zu. Die Platte wird 6 Stunden lang bei 37 °C + 5 % CO₂ inkubiert, bevor mit der weiteren Behandlung fortgefahren wird.
3. Nach 6 Stunden wird die ATP-Stammlösung bis zu einer endgültigen Arbeitskonzentration von 500 nM in die Modellgruppe gegeben. Die Platte wird 45 Minuten lang bei 37 °C + 5 % CO₂ inkubiert, bevor Sie fortfahren.

4. Durchflusszytometrische Analyse (Methode 1)

1. Vorbereitung von Versuchsproben
   1. Keimen und inkubieren Sie die Zellen in 6-Well-Platten gemäß Schritt 2. Richten Sie vier Kontrollgruppen ohne Behandlung ein: eine Kontrolle ohne Färbung, zwei Kontrollen mit einfacher Färbung (eine für jeden Fleck) und eine Kontrolle mit doppelter Färbung. Legen Sie eine Behandlungsgruppe fest und behandeln Sie gemäß Schritt 3.
   2. Nach der Behandlung wird der gesamte Überstand aus den Vertiefungen abgesaugt und mit PBS 2x gewaschen. Geben Sie 500 μl 0,05 % Trypsin (nicht-EDTA) in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 s lang im Inkubator.
   3. Geben Sie 1 ml RPMI-1640 vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung, um die Zellablösung zu verhindern, und sammeln Sie die Zellen in das 5-ml-Röhrchen. Bei 300 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   4. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Legen Sie die Röhrchen mit den Zellen für 3 min in ein Wasserbad bei 37 °C. Alle Proben bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   5. 200 μl 5x Bindungspuffer mit 800 μl destilliertem Wasser auf 1x Bindungspuffer verdünnen. Fügen Sie 100 μl 1x Bindungspuffer hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und übertragen Sie die Zellen in das 5-ml-Röhrchen.
   6. Geben Sie 5 μl Annexin V-PE-Lösung für 10 Minuten in ein Röhrchen mit Zellen der Kontrollgruppe und 5 μl 7-AAD-Lösung für 5 Minuten in ein anderes Röhrchen mit Zellen der Kontrollgruppe (als Einzelfärbekontrollen separat). Wirbeln Sie jedes Röhrchen vorsichtig durch, um die Proben zu mischen, zu färben und bei Raumtemperatur lichtgeschützt zu inkubieren. Geben Sie 400 μl PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es vorsichtig ein, um die Inkubation zu beenden.
   7. 5 μl Annexin V-PE-Lösung in die restlichen Röhrchen geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Wirbeln Sie jedes Röhrchen vorsichtig durch, um die Proben zu mischen, zu färben und bei Raumtemperatur lichtgeschützt zu inkubieren. Nach 5 min 5 μl 7-AAD-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur hinzufügen. Geben Sie 400 μl PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie vorsichtig vortexen, um die Inkubation zu beenden.
   8. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 35-μm-Nylonnetz, das Teil der 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen ist. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und warten Sie auf den Test. Mischen Sie es vor dem Testen vorsichtig und setzen Sie es dann in das Gerät ein.
2. Durchflusszytometrie
   1. Verwenden Sie für die Tests ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortier-Durchflusszytometer. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware für das Durchflusszytometer und bestätigen Sie die Leistung des Detektors und des Lasers. Klicken Sie auf das Zytometer , wählen Sie Fluidik-Start, warten Sie, bis das System bereit ist. Schließen Sie Strömungskammerblasen aus, indem Sie auf Zytometer > Reinigungsmodi > Entgasungs-Durchflusszelle klicken.
   2. Klicken Sie auf Experiment, wählen Sie in der Reihenfolge Neuer Ordner, Experiment, Probe, Röhrchen und Name bearbeiten. Ein fünfeckiger Pfeil vor der Röhre, der grün wird, wenn er aufleuchtet.
   3. Klicken Sie auf das Symbol von Cytometer FACSCelesta (ein Tastenkombinationssymbol), wählen Sie Parameter und dann FSC, SSC und PE-Signal aus. Klicken Sie auf das Symbol des globalen Arbeitsblatts (ein Tastenkombinationssymbol), um das PE-Histogramm zu erstellen. Für das in dieser Studie verwendete Durchflusszytometer ist PE für Annexin V bei 586 nm zu verwenden und auf der X-Achse zu zeichnen; PerCP-Cy5.5 für 7-AAD bei 700 nm und Plot auf der Y-Achse.
   4. Führen Sie zuerst die nicht gefärbte Kontrollprobe in das Gerät ein. Klicken Sie auf das Symbol des Akquise-Dashboards (ein Tastenkombinationssymbol) und rufen Sie mindestens 10.000 Ereignisse aus der gewünschten Population ab. Schließen Sie Ablagerungen mithilfe eines Anschnitts (P1) in einem FSC-A- und SSC-A-Punktdiagramm aus. Stellen Sie die Durchflussmenge auf mittlere Geschwindigkeit ein und zeichnen Sie Daten auf. Passen Sie die Spannung so an, dass die Zellpopulation auf der Diagonale des FSC/SSC-Histogramms platziert wird, und klicken Sie auf Neustart. Stellen Sie die Durchflussmenge auf mittlere Geschwindigkeit ein und zeichnen Sie Daten auf.
   5. Klicken Sie auf Nächstes Rohr und führen Sie die Einzelfärberegler von Annexin V und 7-AAD aus, um die Kompensation anzupassen. Führen Sie die restlichen Röhren aus und sammeln Sie Daten.

5. REM-Bildgebung (Methode 2)

1. Vorbereitung von Versuchsproben
   1. Zellen säen und inkubieren Sie sie in 6-Well-Platten gemäß Schritt 2 und behandeln Sie sie gemäß Schritt 3.
   2. Nach der Behandlung den gesamten Überstand aus den Vertiefungen ansaugen und 2x mit PBS waschen. Geben Sie 500 μl 0,05 % Trypsin (nicht-EDTA) in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 s lang im Inkubator.
   3. Geben Sie 1 ml RPMI-1640 vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung, um die Zellablösung zu verhindern, und sammeln Sie die Zellen in das 5-ml-Röhrchen. Bei 300 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   4. Die Zellen werden 2 h lang bei Raumtemperatur mit 500 μl elektronenmikroskopischem Fixiermittel (2,5 % Glutardialdehyd, 100 mM Phosphorsalze) fixiert, gefolgt von einer Übernachtung bei 4 °C.
   5. Chrom-Alaun-Lösung herstellen: 1,0 g Gelatine in 100 ml Reinstwasser geben, 70 °C im Wasserbad erhitzen und gleichmäßig umrühren. 0,05 g Chrom-Alaun zugeben, gleichmäßig umrühren und mit Filterpapier filtrieren. Tauchen Sie das saubere Deckglas 2 h bei 37 °C in Chrom-Alaun-Lösung und trocknen Sie es für die spätere Verwendung im 37 °C-Ofen.
      HINWEIS: Der Zweck besteht darin, eine Zellablösung während des Experiments zu verhindern.
   6. Sammeln Sie Zellen aus fester Lösung. Bei 300 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Fügen Sie 100 μl PBS hinzu und blasen Sie die Zellen vorsichtig weg. Lassen Sie die Zellensuspension auf das Deckglas fallen, lassen Sie sie 5 Minuten stehen. Saugen Sie den gesamten Überstand an und waschen Sie ihn 3x mit PBS für jeweils 5 Minuten.
      HINWEIS: Der Vorgang muss vorsichtig durchgeführt werden, um eine Zellablösung zu verhindern. Schütteln Sie nicht kräftig, bewegen Sie sich langsam und fügen Sie Flüssigkeit langsam entlang der Wand hinzu.
   7. 500 μl 1%ige Osminsäurefixierung für 1 Stunde zugeben. Saugen Sie den gesamten Überstand an und waschen Sie ihn 3x mit PBS für jeweils 5 Minuten.
   8. Die Proben werden nacheinander in einer Reihe von Ethanol (EtOH)-Konzentrationen (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %) für 15 Minuten pro EtOH-Lösung dehydriert.
      HINWEIS: Die Deckgläser können mehrere Tage bei 4 °C in 100 % EtOH aufbewahrt werden, sollten jedoch so schnell wie möglich trocknen, um eine übermäßige Austrocknung zu vermeiden.
   9. Schalten Sie den Critical-Point-Trockner ein, öffnen Sie den CO_{2 -} Tank, kühlen Sie die Kammer auf 10 °C. Wickeln Sie die Probe bei einem Kammerdruck von 0 psi schnell mit Filterpapier ein und legen Sie sie in die Kammer.
   10. Öffnen Sie das Einlassventil, beobachten Sie durch das CO_{2 -} Beobachtungsfenster, erhöhen Sie den CO₂ -Gehalt der Flüssigkeit zwischen den beiden roten Linien (Obergrenze nicht überschreiten), schließen Sie das Einlassventil. Die Probe 10 Minuten einweichen. Öffnen Sie gleichzeitig das Einlass- und das Auslassventil, um das CO_{2 für} 1 min auszugleichen (flüssiges CO₂ verdrängt EtOH). Schließen Sie das Auslassventil, um den CO₂ -Gehalt der Flüssigkeit in die angegebene Position anzuheben, und schließen Sie das Einlassventil.
   11. Stellen Sie die Temperatur auf 35 °C und den Druck auf 1250 psi ein. Sobald sich Temperatur und Druck stabilisiert haben, wird der Druck bei 100 psi/min abgebaut. Entnehmen Sie die Probe, wenn der Kammerdruck Null ist, und schalten Sie das Gerät aus.
   12. Montieren Sie Proben mit leitfähigem Klebeband auf REM-Aluminium-Probenhaltern. Verwenden Sie einen Sputter-Coater, um die Proben mit einer Schicht (2-5 nm) Gold zu überziehen.
2. Bildgebung
   1. Verwenden Sie hochauflösendes Kaltfeld-Emissions-REM für die Bildgebung. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung des REM auf 3 kV ein. Stellen Sie den Arbeitsabstand auf 10 mm ein. Stellen Sie die Vergrößerung auf 1.000x ein, um das Panorama zu betrachten. Stellen Sie die Vergrößerung auf 5.000x und 20.000x ein, um die Plasmamembran zu lokalisieren und die Probe abzubilden.
      HINWEIS: Der Prozess der Visualisierung von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen mittels REM ist ähnlich wie bei anderen Zell- und Gewebetypen und hängt von den verwendeten Instrumenten ab. Die Referenz¹⁴ bietet ein detailliertes SEM-Protokoll mit begleitenden Videos.

Ergebnisse

Die Zellproben wurden wie im Protokoll beschrieben behandelt und der Durchflusszytometrie-Nachweis wurde durchgeführt. Normale Zellen können nicht mit Annexin V und 7-AAD (Annexin V-/7-AAD-) gefärbt werden. In den frühen Stadien der Pyroptose, Apoptose und Nekroptose war PS exponiert und an Annexin V gebunden, aber die Zellmembran war noch intakt und schloss 7-AAD aus dem extrazellulären Raum aus (Annexin V+/7-AAD-). In den späteren Stadien verliert die Zellmembran ihre Integrität, die Zellen werden gleichzeitig m...

Diskussion

In diesem Manuskript wurden zwei Methoden zum Nachweis von LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen verwendet. Es wurde eine Annexin V/7-AAD-Doppelfärbung verwendet, und die Ergebnisse wurden durchflusszytometrisch aus der Gesamtfärbung analysiert. Wie bei anderen durchflusszytometrischen Analysen wurden eine Gruppe von ungefärbten Zellen und zwei Gruppen von einfach gefärbten Zellen gebildet, um falsch positive und falsch negative Ergebnisse auszuschließen. Die Ergebnisse zeigen, dass n...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1