Aufbereitung von gefrorenen nicht-menschlichen Primateninseln für die kombinierte Einzelkern-RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung sowie Bulk-Metabolomik

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenen nicht-menschlichen Primaten-Pankreasinseln für die Verwendung in der gleichzeitigen Einzelkern-RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung unter Beibehaltung der zytosolischen Massenfraktion für metabolomische Analysen aus denselben Proben.

Zusammenfassung

Eine Herausforderung in Studien mit Gewebe aus mehreren Kohorten besteht darin, Batch-Effekte bei der Vorbereitung groß angelegter Multi-Omik-Experimente zu vermeiden, wie z. B. die kombinierte Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Metabolomik. Die Methode in der aktuellen Studie verwendet schockgefrorene Pankreasinseln von fötalen nicht-menschlichen Primaten, die über einen Zeitraum von zwei Jahren gesammelt wurden, um sie in Einzelkern-RNA-Sequenzierungs- und ATAC-Sequenzierungsassays einzugeben. Die zytosolische Fraktion, die bei der Kernextraktion erzeugt wurde, wurde für die nachgeschaltete Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie und die anschließende Metabolitenquantifizierung beibehalten. Diese Methode ermöglicht die Massenanalyse von Metaboliten, die zu den sich verändernden transkriptomischen und epigenomischen Landschaften beitragen, unter experimentellen Bedingungen. Es ist auf viele Gewebetypen anwendbar und maximiert die Menge an Informationen, die aus Proben extrahiert werden können, die nicht ohne weiteres verfügbar sind. Da der Beitrag des Stoffwechsels zur Etablierung der zellulären Identität durch epigenetische Modifikationen immer mehr geschätzt wird, sind Techniken, die es ermöglichen, den Beitrag von Metaboliten in bestimmten Zelltypen zu identifizieren, zeitgemäß und notwendig.

Einleitung

Die Pankreasinseln von Langerhans sind entscheidend für das Management der Glukosetoleranz während der gesamten Lebensspanne. Wenn der Blutzuckerspiegel nicht über das glukosesenkende Hormon Insulin oder das glukoseerhöhende Hormon Glucagon richtig eingestellt wird, führt dies zu Diabetes mellitus¹. Zu den modifizierbaren Risikofaktoren zur Minimierung des Diabetesrisikos gehören Bewegung und Ernährung. Darüber hinaus wird deutlich, dass sich die Ernährung der Mutter während der Schwangerschaft auch auf die Anfälligkeit der Nachkommen für Diabetes im Erwachsenenalter auswirkt

Protokoll

Die Entnahme von Inselzellen wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Oregon National Primate Research Center (ONPRC) und der Oregon Health and Science University durchgeführt und von der ONPRC IACUC genehmigt. Das ONPRC hält sich an den Animal Welfare Act und die vom US-Landwirtschaftsministerium (USDA) durchgesetzten Vorschriften sowie an die Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory. Das hierin beschriebene Protokoll wurde auf Inseln von fötalen Rhesusaffen angewendet, die am 145. Trächtigkeitstag (Rhesusaffen-Trächtigkeit beträgt typischerweise....

Diskussion

In der Vergangenheit wurden bei den Methoden der Kernisolierung für die Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierung Puffer verwendet, die Detergenzien enthielten, die mit der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), einer gängigen Technik zur Quantifizierung von Metaboliten, unvereinbar sind^16,17. Das derzeitige Protokoll ermöglicht die Kombination von transkriptomischen und metabolomischen Techniken aus derselben Probe.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020