Mitochondriale Transformation bei Baker

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird erklärt, wie Hefe-Mitochondrien mit einer biolistischen Methode transformiert werden können. Wir zeigen auch, wie die Transformanten ausgewählt und gereinigt werden und wie die gewünschte Mutation an der Zielposition innerhalb des mitochondrialen Genoms eingeführt wird.

Zusammenfassung

Die Backhefe Saccharomyces cerevisiae wird seit Jahrzehnten häufig zum Verständnis der mitochondrialen Biologie verwendet. Dieses Modell hat Erkenntnisse über essentielle, konservierte mitochondriale Signalwege zwischen Eukaryoten und Pilz- oder Hefe-spezifischen Signalwegen geliefert. Eine der vielen Fähigkeiten von S. cerevisiae ist die Fähigkeit, das mitochondriale Genom zu manipulieren, was bisher nur bei S. cerevisiae und der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii möglich ist. Die biolistische Transformation der Hefe-Mitochondrien ermöglicht es uns, ortsgerichtete Mutationen einzuführen, Genumlagerungen vorzunehmen und Reporter einzuführen. Diese Ansätze werden hauptsächlich verwendet, um die Mechanismen von zwei hochgradig koordinierten Prozessen in Mitochondrien zu verstehen: die Translation durch Mitoribosomen und die Assemblierung von respiratorischen Komplexen und ATP-Synthase. Die mitochondriale Transformation kann jedoch möglicherweise zur Untersuchung anderer Signalwege verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, wie Hefemitochondrien durch Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss transformiert, das beabsichtigte Transformanten ausgewählt und gereinigt und die gewünschte Mutation in das mitochondriale Genom eingeführt werden kann.

Einleitung

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein weithin anerkanntes Modell zur Untersuchung der mitochondrialen Biogenese. Da es sich bei der Hefe um einen anaeroben, fakultativen Organismus handelt, ist es möglich, die Ursachen und Folgen der Einführung von Mutationen, die die Atmung beeinträchtigen, umfassend zu untersuchen. Darüber hinaus verfügt dieser Organismus über freundliche genetische und biochemische Werkzeuge, um mitochondriale Signalwege zu untersuchen. Eine der leistungsfähigsten Ressourcen zur Erforschung der Mechanismen des Zusammenbaus von Atemwegskomplexen und der mitochondrialen Proteinsynthese ist jedoch die Fähigkeit, Mitochondrien zu transform....

Protokoll

HINWEIS: Wir empfehlen, für jedes Konstrukt sechs Transformationen durchzuführen, da die Effizienz der mitochondrialen Transformation in der Regel gering ist. Die Zusammensetzung der verschiedenen Wachstumsmedien ist in Tabelle 2 dargestellt.

1. Vorbereitung von Wolframpartikeln

1. Wiegen Sie 30 mg 0,7 μm Wolframpartikel (WPs, Microcarrier) in einem Mikroröhrchen. Fügen Sie 1,5 ml 70%iges Ethanol (EtOH) zum Sterilisieren hinzu. Die WPs vernetzen und 10 min bei Raumtemperatur ruhen lassen.
2. Zentrifugieren Sie bei 13.200 x g für 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die WPs, indem Si....

Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde beschrieben, wie Mitochondrien aus der Hefe S. cerevisiae erfolgreich transformiert werden können. Der Prozess, vom Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss bis zur Reinigung des beabsichtigten Hefestammes, dauert ~8-12 Wochen, je nachdem, wie viele Reinigungsrunden des synthetischen Rho^- Stammes notwendig sind. Einige der kritischen Schritte der Methode sind wie folgt. Erstens: Je größer die flankierenden Regionen, die um die Mutationsstelle im mitochondrialen G.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920