Entwicklung kombinatorischer Therapeutika für Rückenmarksverletzungen mittels Stammzelltransfer

Zusammenfassung

In dieser Studie wurden nervenmimetische Komposit-Hydrogele entwickelt und charakterisiert, die zur Untersuchung und Nutzung des pro-regenerativen Verhaltens von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen für die Reparatur von Rückenmarksverletzungen verwendet werden können.

Zusammenfassung

Eine traumatische Rückenmarksverletzung (SCI) führt zu einem dauerhaften sensomotorischen Defizit unterhalb der Verletzungsstelle. In den USA sind etwa eine Viertelmillion Menschen davon betroffen, und sie stellen ein unermessliches Problem für die öffentliche Gesundheit dar. Es wurden Forschungen durchgeführt, um eine wirksame Therapie bereitzustellen. Eine Rückenmarksverletzung gilt jedoch aufgrund der Komplexität der Verletzungsstelle immer noch als unheilbar. Eine Vielzahl von Strategien, darunter die Verabreichung von Medikamenten, Zelltransplantation und injizierbare Biomaterialien, werden untersucht, aber eine Strategie allein schränkt ihre Wirksamkeit bei der Regeneration ein. Daher haben in letzter Zeit kombinatorische Therapien an Aufmerksamkeit gewonnen, die auf die vielfältigen Merkmale der Verletzung abzielen können. Es wurde gezeigt, dass extrazelluläre Matrizen (EZM) die Wirksamkeit von Zelltransplantationen bei Rückenmarksverletzungen erhöhen können. Zu diesem Zweck wurden 3D-Hydrogele, bestehend aus dezellularisierten Rückenmark (dSCs) und Ischiasnerven (dSNs), in unterschiedlichen Verhältnissen entwickelt und charakterisiert. Die histologische Analyse von dSCs und dSNs bestätigte die Entfernung zellulärer und nukleärer Komponenten, und die nativen Gewebearchitekturen blieben nach der Dezellularisierung erhalten. Anschließend wurden Komposit-Hydrogele in unterschiedlichen Volumenverhältnissen hergestellt und Analysen der Trübungsgelierungskinetik, der mechanischen Eigenschaften und der Lebensfähigkeit eingebetteter humaner Fettgewebestammzellen (hASC) unterzogen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften zwischen den verschiedenen Verhältnissen von Hydrogelen und dezellularisierten Rückenmarksmatrizen gefunden. Humane ASC, die in die Gele eingebettet waren, blieben während der gesamten 14-tägigen Kultur lebensfähig. Diese Studie bietet ein Mittel zur Erzeugung von kombinatorischen Hydrogelen, die nervenspezifische EZM und proregenerative mesenchymale Stammzellen aufweisen. Diese Plattform kann mit zukünftigen Untersuchungen neue Einblicke in neuroregenerative Strategien nach Querschnittlähmung liefern.

Einleitung

Ungefähr 296.000 Menschen leiden an traumatischer Rückenmarksverletzung, und jedes Jahr gibt es in den USA etwa 18.000 neue Fälle von Rückenmarksverletzungen1. Traumatische Rückenmarksverletzung wird häufig durch Stürze, Schusswunden, Autounfälle und sportliche Aktivitäten verursacht und führt oft zu einem dauerhaften Verlust der sensomotorischen Funktion unterhalb der Verletzungsstelle. Die geschätzten lebenslangen Kosten für die Behandlung von Querschnittlähmungen liegen zwischen einer und fünf Millionen Dollar pro Person bei deutlich geringerer Lebenserwartung¹. Dennoch ist die Rückenmarksverletzung noch wenig verstanden und weitgehend unheilbar, vor allem aufgrund komplexer pathophysiologischer Folgen nach der Verletzung². Es wurden verschiedene Strategien untersucht, darunter Zelltransplantation und Gerüste auf Basis von Biomaterialien. Während die Transplantation von Zellen und Biomaterialien ihr Potenzial gezeigt hat, deutet die Vielschichtigkeit der Querschnittlähmung darauf hin, dass kombinatorische Ansätze vorteilhafter sein können³. Infolgedessen wurden viele kombinatorische Strategien untersucht, die eine bessere therapeutische Wirksamkeit als einzelne Komponenten gezeigt haben. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um neuartige Biomaterialien für die Verabreichung von Zellen und Medikamenten bereitzustellen³.

Ein vielversprechender Ansatz zur Herstellung natürlicher Hydrogele ist die Dezellularisierung des Gewebes. Bei der Dezellularisierung werden ionische, nichtionische, physikalische und kombinatorische Methoden verwendet, um alle oder die meisten zellulären und nukleären Materialien zu entfernen, während die EZM-Komponenten erhalten bleiben. Durch die Entfernung aller oder der meisten zellulären Komponenten sind aus der EZM gewonnene Hydrogele nach der Implantation/Injektion weniger immunreaktiv gegenüber dem Wirt⁴. Es gibt mehrere Parameter, die gemessen werden müssen, um die Qualität von dezellularisiertem Gewebe zu beurteilen: Entfernung von Zell-/Nukleinstoffen, mechanische Eigenschaften und EZM-Konservierung. Die folgenden Kriterien wurden festgelegt, um unerwünschte Immunreaktionen zu vermeiden: 1) weniger als 50 ng doppelsträngige DNA (dsDNA) pro mg ECM-Trockengewicht, 2) weniger als 200 bp DNA-Fragmentlänge und 3) fast oder kein sichtbares Kernmaterial, das mit 4'6-Diamidino-2-phenuylindol (DAPI)⁵ gefärbt ist. Die mechanischen Eigenschaften können durch Zug-, Druck- und/oder Rheologietests quantifiziert werden und sollten denen des ursprünglichen Gewebes^{ähneln 6}. Darüber hinaus kann die Proteinkonservierung durch Proteomik oder quantitative Assays bewertet werden, die sich auf die Hauptkomponenten dezellularisierter Gewebe konzentrieren, z. B. Laminin, Glykosaminoglykan (GAG) und Chondroitinsulfat-Proteoglykan (CSPG) für das Rückenmark ^7,8. Verifizierte EZM-abgeleitete Hydrogele können mit verschiedenen Zelltypen rezellularisiert werden, um die zellbasierte Therapie zu unterstützen⁹.

Eine Vielzahl von Zelltypen, wie z. B. Schwann-Zellen, olfaktorische Hüllzellen, aus dem Knochenmark gewonnene mesenchymale Stammzellen (MSCs) und neurale Stamm-/Vorläuferzellen, wurden auf die Reparatur von Rückenmarksverletzungen untersucht 10,11,12. Die klinische Verwendung dieser Zellen ist jedoch aufgrund ethischer Bedenken, der spärlichen Integration mit benachbarten Zellen/Geweben, des Mangels an Gewebequellen für eine hohe Ausbeute, der Unfähigkeit zur Selbsterneuerung und/oder der begrenzten proliferativen Kapazität begrenzt 13,14,15. Im Gegensatz zu diesen Zelltypen sind humane aus Fettgewebe gewonnene MSCs (hASCs) ein attraktiver Kandidat, da sie mit Hilfe von Lipoaspiraten leicht und minimalinvasiv isoliert werden können und eine große Anzahl von Zellen gewonnen werden kann¹⁶. Darüber hinaus haben hASCs die Fähigkeit, Wachstumsfaktoren und Zytokine zu sezernieren, die das Potenzial haben, neuroprotektiv, angiogetisch, Wundheilung, Geweberegeneration und Immunsuppression zu bewirken 17,18,19,20,21.

Wie beschrieben, wurden mehrere Studien durchgeführt 22,23,24, und es wurde viel aus ihnen gelernt, aber heterogene Merkmale der Querschnittlähmung haben ihre Wirksamkeit bei der Förderung der funktionellen Erholung eingeschränkt. Daher wurden kombinatorische Ansätze vorgeschlagen, um die Wirksamkeit der Behandlung von Rückenmarksverletzungen zu erhöhen. In dieser Studie wurden Komposit-Hydrogele entwickelt, indem dezellularisierte Rückenmark und Ischiasnerven für eine dreidimensionale (3D) hASC-Kultur kombiniert wurden. Die erfolgreiche Dezellularisierung wurde durch histologische und DNA-Analysen bestätigt, und verschiedene Verhältnisse von Nervenkomposit-Hydrogelen wurden durch Gelationskinetik und Kompressionstests charakterisiert. Die Lebensfähigkeit von hASCs in den Nervenkomposit-Hydrogelen wurde untersucht, um zu beweisen, dass dieses Hydrogel als 3D-Zellkulturplattform verwendet werden kann.

Protokoll

Die Schweinegewebe wurden kommerziell beschafft, so dass eine Genehmigung durch die Tierethikkommission nicht erforderlich war.

1. Dezellularisierung des Rückenmarks des Schweins (Geschätzte Zeit: 5 Tage)

HINWEIS: Die Dezellularisierung wird unter Verwendung der zuvor festgelegten Protokolle mit den Modifikationen^25,26 durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Eingriffe in einer sterilen Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Alle Lösungen sollten mit einem Flaschenaufsatzfilter (0,2 μm Porengröße) in autoklavierte Flaschen sterilfiltriert werden. Eingriffe, die bei 37 °C durchgeführt werden sollen, können in einem Inkubator oder einem sauberen Ofen mit 37 °C durchgeführt werden.

1. Herstellung von Dezellularisierungslösungen
   HINWEIS: Alle Lösungen sind für 1 l berechnet. Es kann sein, dass der Benutzer das endgültige erforderliche Volumen entsprechend seinen experimentellen Anforderungen anpassen muss.
   1. Verdünnen Sie 500 ml 0,05 % Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um 0,025 % Trypsin/EDTA herzustellen.
   2. Verdünnen Sie 300 ml 10 % Triton X-100 mit 700 ml PBS, um 3 % Triton X-100 herzustellen. Mischen Sie 0,56 g NaCl, 1,31 g NaH₂PO₄H₂O und 10,85 g HNa₂O₄P·7H₂O in 1 l deionisiertem Wasser, um 100 mM Na/50 mM Phospuffer herzustellen.
   3. Mischen Sie 32,4 g Saccharose in 1 l entionisiertem Wasser, um 1 M Saccharose herzustellen. Mischen Sie 40 g Natriumdesoxycholat (SD) in 1 l deionisiertem Wasser, um eine 4%ige SD-Lösung herzustellen. Verdünnen Sie 6,7 ml 15 % Peressigsäure mit 993,3 ml 4 % Ethanol.
2. Aufbereitung des Rückenmarks des Schweins
   HINWEIS: Das Rückenmark wurde ohne Lösung gefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
   1. Rückenmark vor der Dezellularisierung bei 4 °C im Kühlschrank 18-24 h auftauen. Verwenden Sie eine sterile Schere, um Dura Mater vorsichtig zu entfernen.
   2. Schneiden Sie das Rückenmark in kleine Stücke (ca. 1 cm lang). Legen Sie ein Stück in ein 15-ml-Röhrchen oder maximal drei Stück in ein 50-ml-Röhrchen.
3. Dezellularisierung des Rückenmarks
   HINWEIS: Nach jedem Schritt werden die Dezellularisierungslösungen manuell in ein großes Becherglas gegossen, um sie zu verwerfen. Ein kleines autoklavierbares Edelstahlsieb kann verwendet werden, um Dezellularisierungslösungen zu verwerfen, ohne das für jeden Schritt benötigte Gewebe zu verlieren. Das Rückenmark wurde, sofern nicht anders angegeben, bei 83 U/min aufgewühlt.
   1. Spülen Sie das Rückenmark 18-24 h lang bei 4 °C und 60 U/min mit entionisiertem Wasser.
   2. Spülen Sie das Rückenmark 1 h lang bei 37 °C und 40 U/min mit 0,025 % Trypsin/EDTA. Spülen Sie dann das Rückenmark 2x 15 Minuten lang mit PBS.
   3. Spülen Sie das Rückenmark 2 h lang mit 3% Triton X-100 aus. Spülen Sie das Rückenmark mit 100 mM Na/50 mM Phospuffer für 15 min, 2x.
   4. Spülen Sie das Rückenmark 1 h lang mit 1 M Saccharose. Spülen Sie dann das Rückenmark 1 h lang mit entionisiertem Wasser aus.
   5. Spülen Sie das Rückenmark 2 h lang mit 4% SD. Spülen Sie dann das Rückenmark mit 100 mM Na/50 mM Phospuffer für 15 min, 2x.
   6. Spülen Sie das Rückenmark 4 h lang mit 0,1 % Peressigsäure in 4 % Ethanol. Spülen Sie dann das Rückenmark 1 Stunde lang mit PBS.
   7. Spülen Sie das Rückenmark 2x 1 h lang mit entionisiertem Wasser aus. Spülen Sie dann das Rückenmark 1 Stunde lang mit PBS.
   8. Das Rückenmark 3 Tage lang bei 0,01 mbar und -56 °C lyophilisieren und bis zur Verwendung trocken lagern.

2. Dezellularisierung des Ischiasnervs des Schweins (Geschätzte Zeit: 5 Tage)

HINWEIS: Führen Sie die Dezellularisierung unter Verwendung eines zuvor festgelegten Protokolls²⁷ durch. Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Eingriffe in einer sterilen Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Alle Lösungen sollten mit einem Flaschenaufsatzfilter (0,2 μm Porengröße) in autoklavierte Flaschen sterilfiltriert werden. Eingriffe, die bei 37 °C durchgeführt werden sollen, können in einem Inkubator oder einem sauberen Ofen mit 37 °C durchgeführt werden.

1. Herstellung von Dezellularisierungslösungen
   HINWEIS: Alle Lösungen sind für 1 l berechnet. Es kann sein, dass der Benutzer das endgültige erforderliche Volumen entsprechend seinen experimentellen Anforderungen anpassen muss.
   1. Bereiten Sie 50 mM Na/10 mM Phospuffer vor, indem Sie 1,86 g NaCl, 0,262 g d NaH₂PO₄H₂O und 2,17 g HNa₂O₄P·7H₂O in 1 l entionisiertem Wasser mischen.
   2. Bereiten Sie eine 125 mM Sulfobetain-10 (SB-10) -Lösung vor, indem Sie 38,4 g SB-10 in 1 l 50 mM Na/10 mM Phospuffer mischen.
   3. Bereiten Sie eine 3%ige SD/0,6 mM Sulfobetain-16 (SB-16)-Lösung vor, indem Sie 30 g SD und 0,24 g SB-16 in 1 l 50 mM Na/10 mM Phospuffer mischen.
2. Vorbereitung des Ischiasnervs des Schweins
   HINWEIS: Ischiasnerven wurden mit PBS gefroren verschickt und bis zur Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
   1. Tauen Sie den Ischiasnerv bei 4 °C im Kühlschrank 18-24 h vor der Dezellularisierung auf.
   2. Den Ischiasnerv in kleine Stücke (ca. 1 cm lang) schneiden. Legen Sie ein Stück in ein 15-ml-Röhrchen oder maximal drei Stück in ein 50-ml-Röhrchen.
3. Dezellularisierung des Ischiasnervs
   HINWEIS: Nach jedem Schritt werden die Dezellularisierungslösungen manuell in ein großes Becherglas gegossen, um sie zu verwerfen, und ein kleines autoklavierbares Edelstahlsieb kann verwendet werden, um die Dezellularisierungslösungen zu verwerfen, ohne das für jeden Schritt benötigte Gewebe zu verlieren. Der Ischiasnerv wurde, sofern nicht anders angegeben, bei 15 U/min erschüttert.
   1. Spülen Sie den Ischiasnerv 7 h lang mit entionisiertem Wasser. Spülen Sie dann den Ischiasnerv mit 125 mM Sulfobetain-10 (SB-10) in 50 mM Na/10 mM Phospuffer für 18 h.
   2. Spülen Sie den Ischiasnerv 15 Minuten lang mit 100 mM Na/50 mM Phospuffer. Spülen Sie dann den Ischiasnerv 2 h lang mit 3 % SD/0,6 mM Sulfobetain-16 (SB-16) in 50 mM Na/10 mM Phospuffer.
   3. Spülen Sie den Ischiasnerv mit 100 mM Na/50 mM Phospuffer für 15 min, 3x. Spülen Sie dann den Ischiasnerv mit 125 mM SB-10 in 50 mM Na/10 mM Phospuffer für 7 h.
   4. Spülen Sie den Ischiasnerv 15 Minuten lang mit 100 mM Na/50 mM Phospuffer. Spülen Sie dann den Ischiasnerv 1,5 h lang mit 3 % SD/0,6 mM SB-16 in 50 mM Na/10 mM Phospuffer.
   5. Spülen Sie den Ischiasnerv mit 50 mM Na/10 mM Phospuffer für 15 min, 3x. Spülen Sie dann den Ischiasnerv 3 h lang ohne Bewegung mit 75 U/ml Desoxyribonuklease (DNase).
   6. Spülen Sie den Ischiasnerv mit 50 mM Na/10 mM Phospuffer für 1 h, 3x. Spülen Sie dann den Ischiasnerv 16 h lang ohne Bewegung bei 37 °C mit 0,2 U/ml Chondroitinase ABC.
   7. Spülen Sie den Ischiasnerv 3 Stunden lang, 3x mit PBS. Den Ischiasnerv 3 Tage lang bei 0,01 mbar und -56 °C lyophilisieren und bis zur Verwendung trocken lagern.

3. Verdauung von dezellularisiertem Gewebe und Herstellung von Komposit-Hydrogelen (Geschätzte Zeit: 4 Tage)

1. Zerkleinern oder zerkleinern Sie das dezellularisierte Gewebe mit einer Schere oder einem Homogenisator zu Pulver. Sterilisieren Sie die Werkzeuge, um das Gewebe in einem Autoklaven bei 121 °C für 45 Minuten zu hacken oder zu zerkleinern. Das Ethylenoxid-Verfahren ist ebenfalls anwendbar.
2. Verdauen Sie das Gewebe separat in 0,01 N Salzsäure (HCl)-Lösung, die 1 mg/ml Pepsin in einer Konzentration von 15 mg/ml enthält. Die geschätzten Gewichte des dezellularisierten Rückenmarks und des Ischiasnervs betragen 50-100 mg bzw. 100-150 mg pro Stück.
3. Setzen Sie den Magnetstab ein und rühren Sie mindestens 4 Tage lang bei 500 U/min und 4 °C, um Pregel-Lösungen zu erzeugen.
4. Mischen Sie das Pregel für den Ischiasnerv und das Rückenmark in den folgenden volumetrischen Verhältnissen: 2:1, 1:1 und 1:2. pH 7,4 mit 1 N Natriumhydroxid (NaOH) und HCl einstellen und mit M199-Medien und 1x PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnen. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
   HINWEIS: Fügen Sie jeweils 1 μl NaOH hinzu. M199-Medien können als pH-Indikator verwendet werden, da sie bei einem pH-Wert von 7,4 hellrosa werden, aber pH-Streifen sollten verwendet werden, um den pH-Wert zu bestätigen.

4. Nachweis der Dezellularisierung

1. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E; Geschätzte Zeit: 8 Tage)
   HINWEIS: Nach jedem Spülschritt werden die Lösungen manuell in ein großes Becherglas gegossen, um sie zu verwerfen.
   1. Frisches und dezellularisiertes Rückenmark und Ischiasnerv 18 h lang in 3,7 % Formaldehyd bei 4 °C fixieren. Legen Sie ein Stück in ein 15-ml-Röhrchen.
   2. Entfernen Sie Formaldehyd und legen Sie das Taschentuch 1 Tag lang in 10% Saccharose. Entfernen Sie 10% Saccharose und legen Sie das Taschentuch 6 Tage lang in 30% Saccharose.
   3. Füllen Sie eine Kryoform in geeigneter Größe zur Hälfte mit optimaler Schnitttemperatur (OCT). Legen Sie das dezellularisierte Gewebe ein, bedecken Sie es mit OCT und lassen Sie es 1 Tag lang das OCT absorbieren.
   4. Nach 1 Tag frieren Sie das Gewebe über Nacht bei -80 °C ein. Kryosektion des Gewebes bei einer Dicke von 10 μm mit einem Kryostaten.
   5. Mit 1x PBS für 5 min, 2x spülen. Anschließend 5 Minuten lang mit Leitungswasser abspülen.
   6. Mit Hämatoxylinlösung 1 min einfärben. 3x 1 Min. mit Leitungswasser spülen.
   7. 1 Min. mit Eosinlösung färben. Spülen mit 95 % Ethanol für 1 min, 2x und mit 100% Ethanol für 1 min, 3x.
   8. 1 Min., 2 Min. und dann 1 Min. mit Xylol spülen. Lassen Sie die Objektträger 5 Minuten trocknen.
   9. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um 3 - 4 Tropfen Dibutylphthalat-Polystyrol-Xylol (DPX)-Lösung auf die Objektträger zu tropfen. Legen Sie die Deckgläser auf die mit DPX bedeckten Objektträger. Lassen Sie die Dias über Nacht trocknen.
2. DNA-Analyse (Geschätzte Zeit: 1 h)
   1. Wiegen Sie dezellularisierte und lyophilisierte Gewebe. Isolierung und Quantifizierung von DNA mit kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.

5. Charakterisierung von Komposit-Hydrogelen

1. Gelierungstrübungstest (Geschätzte Zeit: 1 h)
   1. Geben Sie 100 μl Pregel-Lösungen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte auf Eis. Lesen Sie die Absorption bei 405 nm alle 2 min für 45 min mit einem Plattenlesegerät ab.
   2. Berechnen Sie die normierte Absorption mit der folgenden Gleichung:
      (Extinktion -_{Extinktion Initial}) / (Extinktion_Maximum - Extinktion_Initial)
   3. Berechnen Sie die Steigung der Kurve und die Zeit, um eine Gelierung von 50 % bzw. 95 % zu erreichen, t_1/2 bzw._{t 95}.
2. Kompressionstest (Geschätzte Zeit: 1 min pro Hydrogel)
   1. Herstellung von Komposit-Hydrogelen in einer Konzentration von 12 mg/ml mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 2 mm.
   2. Verwenden Sie ein Rheometer, um die Proben mit einer Last von 250 N zwischen parallelen Edelstahlplatten mit einer Dehnungsrate von 10 % der Probenhöhe/min zu komprimieren. Die Software, die Rheometer-Messwerte liefert, liefert eine Spannungs-Dehnungs-Kurve, indem sie die Kraft aufbringt und die Dehnung misst, bis die Hydrogele brechen.
   3. Berechnen Sie den Elastizitätsmodul aus der Steigung des linearen Bereichs der Spannungs-Dehnungs-Kurven.

6. Dreidimensionale Kultivierung humaner ASCs in Nervenkomposit-Hydrogelen

1. Vorbereitung der dreidimensionalen (3D) Plattform (Geschätzte Zeit: 3 h)
   1. Ätzen Sie einen Siliziumwafer mit SU-8-Fotolack zur Erzeugung von kreisförmigen Strukturen mit einer Tiefe von 200 μm und einem Durchmesser von 4 mm.
   2. Polydimethylsiloxan (PDMS)-Base und Härter im Verhältnis 10:1 mischen. Gießen Sie die Mischung auf den Silikonwafer und lassen Sie sie 20 Minuten einwirken, um alle Blasen zu entfernen, die durch das Mischen der PDMS-Basis und des Härters entstehen.
   3. In den Ofen schieben und 2 h bei 70 °C aushärten. Entformen Sie das ausgehärtete PDMS-Blatt und stanzen Sie es mit einer Biopsie-Stanze mit einem Durchmesser von 8 mm aus, um PDMS-Mikrovertiefungen herzustellen.
   4. Platzieren Sie Mikrowells in einer 96-Well-Platte und legen Sie die Well-Platte in einen Luft-Plasma-Reiniger, um PDMS-Mikrowells zu sterilisieren.
   5. Funktionalisieren Sie PDMS-Mikrovertiefungen mit 1 % Polyethylenimin (PEI) und 0,1 % Glutaraldehyd (GA) für 10 min bzw. 20 min. Mikrowells mit destilliertem Wasser waschen, 2x.
2. Vorbereitung der hASCs (Geschätzte Zeit: 7 Tage)
   1. Kultivieren Sie Passagezellen für 2-5 Passagen in hASCs Wachstumsmedien (hASCs Basalmedien, ergänzt mit fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin (Pen-Streptokokken)) bis zur Konfluente. Passieren und berechnen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämazytometer oder Zellzähler.
3. ASC-geladene Nervenkomposit-Hydrogele (Geschätzte Zeit: 2 h)
   1. Mischen Sie das Pregel für den Ischiasnerv und das Rückenmark in einem volumetrischen Verhältnis von 2:1, 1:1, 1:2 und bereiten Sie ein Hydrogel nur für das Rückenmark vor, ohne ein Pregel für den Ischiasnerv einzumischen.
   2. Fügen Sie M199-Medien hinzu und stellen Sie den pH-Wert 7,4 mit 1 N, NaOH und HCl ein. Resuspendieren Sie hASCs mit Wachstumsmedien im Pregel bei einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml.
      HINWEIS: Die Menge an M199 und Zellsuspension sollte 10 % des Pregels betragen.
   3. Verdünnen Sie das Pregel auf 12 mg/ml mit 1x PBS. Das Pregel in Mikrovertiefungen geben und 30 Minuten inkubieren. Kultur von ASC-beladenen Hydrogelen in hASCs-Wachstumsmedien.
4. Zellviabilitätstest (Geschätzte Zeit: 4 h pro Tag)
   1. Bereiten Sie Machbarkeitstestlösungen unter Verwendung handelsüblicher Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   2. Aspirieren Sie Medien an den Tagen 1, 4, 7 und 14. Geben Sie das Reagenz in die Vertiefungen und inkubieren Sie es 3 Stunden lang bei 37 °C gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Lesen Sie die Fluoreszenz bei Anregung/Emission von 560/590 nm mit einem Platten-Reader. Berechnen Sie die prozentuale Differenz mit der folgenden Gleichung:
      [(_{Fluoreszenzprobe} -_{Fluoreszenz-Leerzeichen}) /_{Fluoreszenz-Leerzeichen}] x 100

Ergebnisse

Dezellularisierte Gewebe wurden unter Verwendung zuvor etablierter Protokolle mit leichten Modifikationen hergestellt^26,27. Nach Dezellularisierung, Lyophilisierung und Verdauung wurden Nervenkomposit-Hydrogele im Verhältnis SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 und reine Rückenmarks-Hydrogele hergestellt (Abbildung 1). Die Entfernung der Kernbestandteile wurde durch H&E-Färbung bestätigt (A...

Diskussion

Es wird allgemein angenommen, dass die Pathophysiologie der Rückenmarksverletzung komplex und facettenreich ist. Auch wenn einzelne Therapien wie Zelltransplantation, Wirkstoffverabreichung und Biomaterialien jeweils wertvolle Einblicke in die Rückenmarksverletzung geliefert haben, kann die komplizierte Natur der Rückenmarksverletzung ihre individuelle Wirksamkeit einschränken 28,29,30,31.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner salt	Sigma-Aldrich	D4266	Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate	Sigma-Aldrich	H6883	Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagent	Fisher Scientific	DAL1100	Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C3667	Used during sciatic nerve decellularization
Cryostat	Leica	CM1860
Deoxyribonuclase	Sigma-Aldrich	D4263	Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	VWR	BDH9296	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69506	Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting medium	Sigma-Aldrich	6522	Used during H&E staining
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110216	Used during H&E staining
Ethanol	VWR	89125-172
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)	Sigma-Aldrich	G6257	Used during PDMS surface functionalization
hASC growth media	Lonza	PT-4505	Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
Hematoxylin	VWR	26041-06	Used during H&E staining
human adipose-derived stem cell	Lonza	PT-5006
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 media	Sigma-Aldrich	M0650	Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compound	Tissue-Tek	4583
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7000	Used to digest decellularized tissues
Peracetic acid	Lab Alley	PAA1001	Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR	97062-948
Plate reader	BioTek Instruments	Synergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)	Sigma-Aldrich	181978	Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerve	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cord	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA system	Promega	E2670	Used to analyze DNA contents
Rheometer	TA Instruments	DHR 2
Rugged rotator	Glas-co	099A RD4512	Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)	VWR	BDH9286	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	VWR	BDH9298	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)	Sigma-Aldrich	415443	Used to adjust pregels solutions
SU-8	Kayaku advnaced materials	SU8-100	Used to coat silicon wafer
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW	1317318	Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062	Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotator	Thermo Fisher	88881001	Used during sciatic nerve decellularization
Xylene	VWR	MK866816	Used during H&E staining