Eine vielseitige Pipeline für die Analyse dynamischer Veränderungen in Kernkörpern in einer Vielzahl von Zelltypen

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt ein Immunfluoreszenzprotokoll und eine Quantifizierungspipeline zur Bewertung der Proteinverteilung mit unterschiedlichen Kernorganisationsmustern in humanen T-Lymphozyten. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, beginnend bei der Probenvorbereitung über die Durchführung halbautomatischer Analysen in Fidschi bis hin zur Datenverarbeitung durch ein Google Colab-Notebook.

Zusammenfassung

Verschiedene nukleäre Prozesse, wie z. B. die transkriptionelle Kontrolle, finden in diskreten Strukturen statt, die als Foki bekannt sind und durch die Immunfluoreszenztechnik erkennbar sind. Die Untersuchung der Dynamik dieser Herde unter verschiedenen zellulären Bedingungen mittels Mikroskopie liefert wertvolle Einblicke in die molekularen Mechanismen, die die zelluläre Identität und Funktionen steuern. Die Durchführung von Immunfluoreszenz-Assays über verschiedene Zelltypen hinweg und die Beurteilung von Veränderungen in der Assemblierung, Diffusion und Verteilung dieser Herde stellen jedoch zahlreiche Herausforderungen dar. Diese Herausforderungen umfassen die Komplexität der Probenvorbereitung, die Bestimmung von Parametern für die Analyse von Bilddaten und das Management großer Datenmengen. Darüber hinaus sind bestehende Bildgebungs-Workflows oft auf erfahrene Benutzer zugeschnitten, wodurch der Zugang für ein breiteres Publikum eingeschränkt wird.

In dieser Studie stellen wir ein optimiertes Immunfluoreszenzprotokoll vor, das auf die Untersuchung von Kernproteinen in verschiedenen humanen primären T-Zelltypen zugeschnitten ist und für jedes Protein von Interesse und Zelltyp angepasst werden kann. Darüber hinaus stellen wir eine Methode zur unvoreingenommenen Quantifizierung der Proteinfärbung vor, unabhängig davon, ob sie unterschiedliche Foki bilden oder eine diffuse Kernverteilung aufweisen.

Die von uns vorgeschlagene Methode bietet einen umfassenden Leitfaden, von der zellulären Färbung bis zur Analyse, und nutzt dabei eine halbautomatische Pipeline, die in Jython entwickelt wurde und auf Fidschi ausgeführt werden kann. Darüber hinaus stellen wir ein benutzerfreundliches Python-Skript zur Verfügung, um die Datenverwaltung zu rationalisieren, das auf einem Google Colab-Notebook öffentlich zugänglich ist. Unser Ansatz hat sich als wirksam erwiesen, indem er hochinformative Immunfluoreszenzanalysen für Proteine mit unterschiedlichen Mustern der Kernorganisation in verschiedenen Kontexten liefert.

Einleitung

Die Organisation des eukaryotischen Genoms wird durch mehrere Schichten epigenetischer Modifikationen¹ gesteuert, die mehrere Kernfunktionen koordinieren, die in spezialisierten Kompartimenten, den sogenannten Kernkörpern oder Kondensaten, ablaufen können². Innerhalb dieser Strukturen finden Prozesse wie die Transkriptionsinitiierung³, die RNA-Prozessierung ^4,5,6, die DNA-Reparatur ^7,8, die Ribosomenbiogenese

Protokoll

Die Verwendung von menschlichen Proben zu Forschungszwecken wurde von den Ethikkommissionen der Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Mailand) genehmigt, und es wurde die Einverständniserklärung aller Probanden eingeholt (Zulassungsnummern: 708_2020). Das Protokoll ist in drei Hauptabschnitte unterteilt: Immunfluoreszenzausführung, Bildaufnahme und Bildanalyse. Im Durchschnitt dauert es 4 Arbeitstage, um fertig zu werden (Abbildung 1).

1. Immunfluoreszenz-Vorbereitung

HINWEIS: Dieses Immunfluores....

Diskussion

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Durchführung von Immunfluoreszenzexperimenten an nukleären Proteinen in humanen T-Lymphozyten vor. Diese Methode bietet Flexibilität für den Einsatz mit verschiedenen Zelltypen durch geringfügige Modifikationen in den Fixierungs- und Permeabilisierungsschritten, wie zuvor beschrieben^30,31.

Unser Imaging-Workflow baut auf etablierten Techniken auf, die in der Literatur beschrieben sind,.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1