Generierung und Analyse von High-Parameter-Histologiebildern mit Histoflow-Zytometrie

Zusammenfassung

Hier wird ein Verfahren beschrieben, mit dem fünf oder mehr Fluoreszenzparameter mittels Immunfluoreszenzmikroskopie abgebildet werden können. Es wird eine Analysepipeline für die Extraktion einzelner Zellen aus diesen Bildern und die Durchführung von Einzelzellanalysen durch durchflusszytometrie-ähnliche Gating-Strategien skizziert, mit der Zelluntergruppen in Gewebeschnitten identifiziert werden können.

Zusammenfassung

Die Verwendung der Histologie zur Untersuchung der Immunzelldiversität in Gewebeschnitten, wie sie aus dem Zentralnervensystem (ZNS) stammen, ist durch die Anzahl der Fluoreszenzparameter, die gleichzeitig abgebildet werden können, entscheidend begrenzt. Die meisten Untergruppen von Immunzellen wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung komplexer Kombinationen von Proteinmarkern definiert, die oft vier oder mehr Parameter zur endgültigen Identifizierung erfordern, was über die Möglichkeiten der meisten herkömmlichen Mikroskope hinausgeht. Da die Durchflusszytometrie Gewebe dissoziiert und räumliche Informationen verliert, besteht ein Bedarf an Techniken, die räumliche Informationen speichern und gleichzeitig die Rollen komplexer Zelltypen hinterfragen können. Diese Probleme werden hier angegangen, indem eine Methode zur Erweiterung der Anzahl der Fluoreszenzparameter entwickelt wird, die abgebildet werden können, indem die Signale von spektral überlappenden Fluorophoren gesammelt und die Signale jedes einzelnen Fluorophors durch spektrale Entmischung getrennt werden. Diese Bilder werden dann mit einer Analysepipeline verarbeitet, um histologische Bilder mit hohen Parametern aufzunehmen und einzelne Zellen aus diesen Bildern zu extrahieren, so dass die einzigartigen Fluoreszenzeigenschaften jeder Zelle auf Einzelzellebene analysiert werden können. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie-ähnlichen Gating-Strategien können Zellen dann in Untergruppen profiliert und auf die Histologieschnitte zurückgeführt werden, um nicht nur ihre Häufigkeit zu quantifizieren, sondern auch festzustellen, wie sie mit der Gewebeumgebung interagieren. Insgesamt wird die Einfachheit und das Potenzial der Verwendung der Histoflow-Zytometrie zur Untersuchung komplexer Immunpopulationen in histologischen Abschnitten demonstriert.

Einleitung

Entzündungen, die von Zellen des Immunsystems und Gliazellen ausgelöst werden, können zu chronischen Erkrankungen des ZNS beitragen, bei denen jede Population die Aktivität der anderen fördern kann ^1,2,3. Zu verstehen, wie das Immunsystem mit diesen Elementen des ZNS interagiert, um eine ZNS-Entzündung zu fördern, ist derzeit ein wichtiges Thema von Interesse und wurde durch hochparametrische Techniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung erheblich erleichtert. Durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung haben wir entdeckt, dass bei mehreren ZNS-Erkrankungen eine umfangreiche Kommunik....

Protokoll

Dieses Protokoll gilt nicht für das Schneiden von Geweben für die Histologie; Bitte lesen Sie Jain et ^al.18 oder¹⁹ für Beschreibungen, wie Gewebe für die Histologie geschnitten werden. Dieses Protokoll kann mit allen geschnittenen Geweben auf Objektträgern verwendet werden. In diesem Artikel werden leistenale Lymphknoten verwendet, die von einem immunisierten Tier isoliert wurden, wie zuvor beschrieben¹⁸. Das Verfahren und der Zeitplan für dieses Protokoll sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie ....

Diskussion

Hier wird der Einsatz der Histoflow-Zytometrie beschrieben, eine Technik, die bereits zuvor validiert wurde¹⁸. Es wird gezeigt, dass bei der Färbung von Gewebeschnitten mit spektral überlappenden Farbstoffen dieses Durchscheinen über Kanäle mittels spektraler Kompensation entfernt werden kann, was dazu führt, dass eine größere Anzahl von Fluoreszenzparametern eindeutig aufgelöst wird, als dies normalerweise mit herkömmlichen Methoden möglich wäre. Da Histologiebilder mit hohen Parameter.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42