Optimierung der Tränensammlung bei Mäusen für die mRNA- und Proteinanalyse

Zusammenfassung

Die Identifizierung von RNA- und Protein-Biomarkern aus Rissen in Mausmodellen ist vielversprechend für die Frühdiagnostik verschiedener Krankheiten. Dieses Manuskript bietet ein umfassendes Protokoll zur Optimierung der Wirksamkeit und Effizienz der mRNA- und Proteinisolierung aus Maustränen.

Zusammenfassung

Der Tränenfilm ist eine hochdynamische Bioflüssigkeit, die in der Lage ist, pathologische molekulare Veränderungen nicht nur in der Augenoberfläche, sondern auch in anderen Geweben und Organen widerzuspiegeln. Die molekulare Analyse dieser Bioflüssigkeit bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, Krankheiten zu diagnostizieren oder zu überwachen, die Wirksamkeit medizinischer Behandlungen zu beurteilen und mögliche Biomarker zu identifizieren. Aufgrund des begrenzten Probenvolumens erfordert die Entnahme von Tränenproben spezifische Fähigkeiten und geeignete Werkzeuge, um eine hohe Qualität und maximale Effizienz zu gewährleisten. In Humanstudien wurden verschiedene Methoden der Tränenprobenahme beschrieben. In diesem Artikel wird eine umfassende Beschreibung eines optimierten Protokolls vorgestellt, das speziell auf die Extraktion tränenbezogener Proteininformationen aus experimentellen Tiermodellen, insbesondere Mäusen, zugeschnitten ist. Diese Methode umfasst die pharmakologische Stimulation der Tränenproduktion bei 2 Monate alten Mäusen, gefolgt von der Probenentnahme mit Schirmer-Streifen und der Bewertung der Wirksamkeit und Effizienz des Protokolls durch Standardverfahren, SDS-PAGE, qPCR und digitale PCR (dPCR). Dieses Protokoll kann leicht für die Untersuchung der Tränenproteinsignatur in einer Vielzahl von experimentellen Paradigmen angepasst werden. Durch die Etablierung eines erschwinglichen, standardisierten und optimierten Tränenentnahmeprotokolls für Tiermodelle sollte die Lücke zwischen Human- und Tierforschung geschlossen, translationale Studien erleichtert und der Fortschritt auf dem Gebiet der Erforschung von Augen- und systemischen Erkrankungen beschleunigt werden.

Einleitung

Tränen gelten als Plasma-Ultrafiltrat und wurden aufgrund einer signifikanten Überlappung der Biomoleküle, die sie teilen, auch als Zwischenflüssigkeit zwischen Plasmaserum und Liquor cerebrospinalis beschrieben¹. Es wurde berichtet, dass menschliche Tränen Proteine, Tränenlipide, Metaboliten und Elektrolyte enthalten². In jüngster Zeit wurden auch andere Biomoleküle wie mRNAs, miRNAs und extrazelluläre Vesikel identifiziert 3,4,5,6,7.

Beim Menschen befinden sich die Basaltränen im Tränenfilm, der aus drei Schichten besteht: der äußeren Lipidschicht, die die Tränenoberfläche glatt hält, damit wir hindurchsehen können und die Verdunstung der Tränen verhindert wird; die mittlere wässrige Schicht, die das Auge mit Feuchtigkeit versorgt, Bakterien abweist, die Hornhaut schützt und 90 % des Tränenfilms ausmacht; Und schließlich die Muzinschicht, eine Familie von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, die mit der Hornhaut in Kontakt kommen und es der Träne ermöglichen, am Auge zu haften⁸. Die Tränenverteilung über die Augenoberfläche beginnt mit der Sekretion aus der Tränendrüse. Diese Flüssigkeit wird dann durch Tränenkanäle geleitet, um über die Augenoberfläche zu fließen und in die Abflusskanäle zu fließen. Mit jedem Blinzeln können sich die Tränen gleichmäßig über das gesamte Auge verteilen und es bleibt feucht⁹.

Der Tränenfilm ist eine hochdynamische Bioflüssigkeit, die in der Lage ist, molekulare Veränderungen widerzuspiegeln, die nicht nur auf der Augenoberfläche, sondern auch in anderen Geweben und Organen auftreten. Die Analyse der differentiellen Expression in dieser Bioflüssigkeit stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Entdeckung von Biomarkern bei menschlichen Krankheiten^{dar 10,11}. Die Verwendung von Tränenfilm als Quelle von Biomarkern für die Früherkennung verschiedener Pathologien wurde durch das Vorhandensein nicht-invasiver Entnahmemethoden erheblich erleichtert. Die gebräuchlichste Methode zum Sammeln von Tränen in Human- und Tierkliniken ist eine membranbasierte Stütze (Schirmer-Streifen), die nach dem Prinzip der Kapillarwirkung funktioniert und es dem Wasser in den Tränen ermöglicht, entlang der Länge eines Papierteststreifens oder von Kapillarröhrchen zu wandern, die in den unteren Bindehautsack des Probanden eingesetzt werden 12,13,14. Trotz der inhärenten Einschränkung, mit dieser Methode ein kleines Probenvolumen zu erhalten, hat die biochemische Analyse der Tränenzusammensetzung unter Verwendung verschiedener empfindlicher Techniken die Identifizierung potenzieller Biomarkermoleküle erleichtert^11,15. Protokolle zur Optimierung und Bewertung der Elution von Tränenproteinen aus Schirmer-Streifen und Kapillaren bei menschlichen Patienten sind gut dokumentiert^16,17. Vollständige Beschreibungen von optimierten Protokollen, die speziell entwickelt wurden, um molekulare Informationen über Tränen aus experimentellen Tiermodellen zu extrahieren, sind jedoch verfügbar, aber rar. Bestehende Methoden, wie z. B. die Träneninduktion durch direkte Stimulation der Tränendrüse¹⁸, ermöglichen zwar die Entnahme größerer Volumina, sind jedoch invasiv und können bei den Tieren zu Beschwerden führen. Nicht-invasive Methoden, wie das Sammeln von Rissen von der Augenoberfläche, wurden als eine Möglichkeit zur Isolierung von DNA und miRNAs beschrieben^19,21.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine kostengünstige und optimierte Methode zur Sammlung und Verarbeitung von Tränen bei Mäusen zu etablieren. Die Methode legt den Schwerpunkt auf die Nicht-Invasivität und erhält gleichzeitig ausreichende Tränenvolumen, die für die molekulare Analyse durch Techniken wie SDS-PAGE, qPCR und dPCR geeignet sind. Die Informationen über den extrahierten Protein- und mRNA-Gehalt können dann genutzt werden, um potenzielle Biomarker in bestehenden experimentellen Krankheitsmodellen zu identifizieren.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der Tierethikkommission von Cinvestav genehmigt (CICUAL, # 0354/23). Die Labortiere wurden in strikter Übereinstimmung mit den Tierverwendungsrichtlinien der Zeitschrift und gemäß der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung behandelt und behandelt. Die Augengesundheit vor und nach den Eingriffen wurde durch die Beurteilung von Augenausfluss, geschwollenen Augenlidern, Augenanomalien und Verhaltensänderungen bewertet.

1. Tiere und Reagenzienzubereitung

1. Verwenden Sie für das Verfahren drei 2 Monate alte männliche C57BL/6-Mäuse pro Replikat mit einem Startgewicht von ~25 g (Abbildung 1). Bearbeiten Sie jede Maus einzeln und legen Sie sie auf ein Heizkissen, um die Wärme zu erhalten.
2. Um die Tränensekretion zu induzieren, bereiten Sie eine Stammlösung von Pilocarpin in einer Dosis von 20 mg/ml mit sterilem Wasser vor.
3. Schneiden Sie die Schirmer-Teststreifen auf eine Länge von 5 mm zu und biegen Sie jeden Streifen an der Kerbe in einem 90°-Winkel.
4. Bereiten Sie 250 μl steriles Wasser mit einem Proteasehmer vor (1 Tablette für 50 ml, gemäß den Anweisungen des Herstellers).

2. Anregung und Sammlung der Tränenproduktion

1. Wiegen Sie jede Maus einzeln, um die geeignete Dosierung der Behandlungen zu berechnen.
2. Um die Tränenproduktion zu stimulieren, verabreichen Sie 30 mg/kg Pilocarpin intraperitoneal mit einer 6-mm-Insulinspritze (Abbildung 1B). Warten Sie 2 Minuten nach der Injektion, bis sich die Wirkung manifestiert.
   HINWEIS: Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Tränenflüssigkeit konnten keine Daten von nicht stimulierten Tieren erhoben werden.
3. Sammeln Sie die Tränen, indem Sie das Ende jedes Schirmer-Streifenfragments mit einer Pinzette über die Mitte des unteren Augenlids legen und an Ort und Stelle halten, bis der Riss die Streifengrenze erreicht (Abbildung 1C). Ersetzen Sie dann den Streifen. Platzieren Sie nacheinander 2 Schirmer-Streifen in jedem Auge, mit einem Abstand von 2 Minuten zwischen den Streifen für die Entnahme. Für die Tränensammlung werden etwa vier Streifenfragmente über 10 min pro Maus benötigt.
4. Legen Sie die Schirmer-Streifenfragmente in sterilen Röhrchen auf Eis, um eine Degradation der Komponenten zu vermeiden. Sobald die Sammlung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit der Tränenverarbeitung.

3. Isolierung von Proteinen

1. Die Streifenfragmente werden in ein 600-μl-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 20 μl steriles Wasser mit einem Proteaseinhibitor enthält, und 1 h bei 600 x g bei 4 °C zentrifugiert, wie zuvor gezeigt¹⁷ (Abbildung 1D).
2. Führen Sie eine Punktion mit einer 7,5 cm langen Injektornadel aus Edelstahl an der Spitze des 600-μl-Röhrchens mit der Probe durch (Abbildung 1E). Übertragen Sie dann dieses punktierte Röhrchen in ein neues sterilisiertes 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C, wie zuvor berichtet¹⁷, um das Volumen der verdünnten Tränen zurückzugewinnen. Das Volumen des Tränenfilms (Überstand) befindet sich am Boden der Tube.
3. Erstellen Sie einen Proteinpool, indem Sie den Überstand aus allen Proben kombinieren. In diesem Experiment wurde ein Gesamtvolumen von ca. 200 μl erhalten.
   HINWEIS: Die Tränenproduktion kann über 1 Stunde dauern. In dieser Zeit können noch Tränen aufgefangen werden.
4. Quantifizieren Sie den Gesamtproteingehalt des Tränenpools unter Verwendung der Bradford-Standardmethode²².

4. SDS-PAGE-Analyse

1. Erhitzen Sie die Proteinproben 4 min lang bei 99 °C, um die Proteine zu denaturieren. Die Proben kurz vortexen, um die Komponenten zu vermischen.
2. Laden Sie 30 μg quantifizierten Proteingehalt aus jeder Probe auf ein 10%iges SDS-PAGE-Gel (Tabelle 1) und lassen Sie die Proben 2 h lang bei 90 V mit einer Standardmethode²³ laufen.
3. Nach der Elektrophorese das Gel mit Färbelösung (Tabelle 1) bedecken und 30 Minuten inkubieren, um die Proteine zu färben.
4. Spülen Sie das Gel mehrmals mit der Entfärbungslösung aus, bis der Hintergrund klar wird und Proteinbanden sichtbar sind.
5. Erfassen Sie Bilder mit einem Gel-Dokumentationssystem.

5. mRNA-Isolierung für qPCR und digitale PCR

1. Legen Sie die Streifen in ein 600-μl-Mikrozentrifugenröhrchen mit 20 μl sterilem Wasser. Machen Sie eine Punktion an der Spitze des Röhrchens, das die Probe enthält, geben Sie es in ein neues sterilisiertes 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie, wie zuvor in Human Tears³ berichtet, für 20 Minuten bei 2.000 x g bei 4 °C (Abbildung 1E-H).
2. Erstellen Sie einen Pool aus allen Beispielen. Das gewonnene Volumen dieses Experiments betrug etwa 22 μl Überstand für jede Maus, d.h. 66 μl Gesamtvolumen. Legen Sie die Röhrchen auf Trockeneis, um den Abbau von Biomolekülen zu vermeiden.
3. 200 μl monophasische Lösung aus Phenol und Guanidiniumisothiocyanat (kommerziell erhältlich) zugeben und durch Pipettieren homogenisieren. 5 min bei Raumtemperatur ziehen lassen. In diesem Schritt können die Proben mehrere Wochen lang bei -20 °C oder mehrere Monate lang bei -70 °C gelagert werden.
4. 40 μl Chloroform zugeben und 15 s in einem Wirbel einmischen. 2 min bei Raumtemperatur ziehen lassen. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C.
5. Übertragen Sie die wässrige Phase vorsichtig (ohne die Interphase zu nehmen) in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
6. 0,5 μl Glykogen (0,05 μg/μl) zu 100 μl Isopropanol geben und durch Pipettieren mischen. Glykogen wird mit der RNA co-präzipitiert und beeinträchtigt die nachfolgenden Schritte nicht.
7. 10 min bei -20 °C ziehen lassen. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand schnell dekantieren.
8. Fügen Sie 200 μl kaltes 75%iges Ethanol hinzu und resuspendieren Sie das RNA-Pellet durch Vortexen. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 5 min bei 4 °C.
9. Dekantieren Sie das Ethanol. Lassen Sie den Schlauch 20-30 Minuten an der Luft trocknen, ohne ihn umzudrehen. 20 μl RNase-freies Wasser zugeben und resuspendieren.
10. Fahren Sie mit dem Ablesen der optischen Dichte im Mikrovolumen-Spektrophotometer bei 260 nm und 280 nm fort, um die Reinheit der RNA zu beurteilen. Die Proben müssen auf Eis sein.
    HINWEIS: Die ribosomalen Banden 28S und 18S können aufgrund der Art der Probe nicht mit einem Agarosegel beobachtet werden. Das Vorhandensein anderer RNAs, wie z. B. miRNAs oder mRNAs, kann mit einem Bioanalysator analysiert werden, wie zuvor gezeigt¹⁸.
11. Synthetisieren Sie die cDNA aus Tears-RNA mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    1. Beginnen Sie mit einer Eingangs-RNA in einem Bereich von 10 ng bis 5000 ng; Je nach verwendetem Kit mischen Sie es mit 1 μL Oligo (dT) und bis zu 12 μL RNase-freiem Wasser. Bei 500 x g 30 s schleudern und bei 65 °C 5 min inkubieren.
    2. In das Mischröhrchen werden 4 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl RNase-Inhibitor, 2 μl dNTP-Mix und 1 μl reverse Transkriptase gegeben.
    3. Die Tube bei 500 x g für 30 s drehen, um die Mischung nach unten zu ziehen. Inkubieren Sie das Röhrchen dann 60 Minuten lang bei 42 °C. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 70 °C inkubieren.
12. Aufgrund der geringen Konzentration von mRNA in Tränen wird empfohlen, unverdünnte cDNA für die qPCR²⁴ zu verwenden. Für dieses Experiment wurden 150 ng cDNA verwendet. Führen Sie die qPCR mit DNMT3a-Primern durch:
    Vorwärts: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Rückseite: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA und GAPDH Primer:
    Vorwärts: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Rückwärts: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC gemäß den Anweisungen der Hersteller und Geräteverfahren.
    1. Verwenden Sie für den qPCR-Zyklus das folgende Programm: Anfängliche Denaturierung: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen von 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s und 72 °C - 30 s, enden mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten.
    2. Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse durch, um das Vorhandensein von Primer-Dimeren oder unspezifischen Amplikons in der Reaktion zu beurteilen. Die Temperaturrampe begann von 50 °C bis zu 99 °C, mit einer anfänglichen Wartezeit von 90 s für den ersten Schritt und einer Wartezeit von 5 s zwischen jedem Schritt.
    3. Führen Sie für die dPCR²⁵ serielle Verdünnungen durch, um die Menge an cDNA zu optimieren, die zum Nachweis der interessierenden mRNA erforderlich ist. In diesem Experiment werden die folgenden Verdünnungen von cDNA in nukleasefreiem Wasser verwendet: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng und 18,75 ng cDNA. Es wurden die bereits erwähnten Primer für DNMT3a verwendet. Für den dPCR-Zyklus verwenden Sie das folgende Programm: Erstdenaturierung: 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C - 15 s und 60 °C - 30 s.

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Ergebnisse

Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll bietet eine einfache und erschwingliche Methode zur Gewinnung molekularer Informationen aus Tränenflüssigkeit unter Verwendung von Techniken, die in den meisten molekularbiologischen Laboratorien üblicherweise verfügbar sind. Darüber hinaus kann das Protokoll durch den Einsatz hochempfindlicher Techniken wie ELISA zum Nachweis der enzymatischen Aktivität skaliert werden.

Nach diesen Verfahren betrug die Gesamtproteinausbeute etwa 3-4 μg/μl. ...

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Diskussion

Tränenflüssigkeit ist leicht zugänglich, und die Bestimmung von Biomarkern in Tränen kann als erfolgreiche ergänzende Technik zur Früherkennung verschiedener menschlicher Krankheiten eingesetzt werden²⁷. Während die biochemische Analyse der Tränenzusammensetzung in experimentellen Tiermodellen diesen Ansatz ergänzt und erhebliche Fortschritte beim Verständnis der molekularen Grundlagen von Krankheiten verspricht, gibt es einen Mangel an verfügbaren Daten und Protokollen, was uns dazu ve...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A