Molekulare Bildgebung von Organoiden des menschlichen Gehirns mittels Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Für die massenspektrometrische Bildgebung (MSI) von Hirnorganoiden wurde eine fortschrittliche Methode entwickelt, die es ermöglicht, die Metabolitenverteilungen innerhalb dieser Modelle abzubilden. Diese Technologie bietet Einblicke in die Stoffwechselwege und Metabolitensignaturen des Gehirns während der frühen Entwicklung und bei Krankheiten und verspricht ein tieferes Verständnis der menschlichen Gehirnfunktion.

Zusammenfassung

Organoidmodelle des Gehirns dienen als leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion des menschlichen Gehirns. Die massenspektrometrische Bildgebung (MSI), eine hochmoderne Technologie, ermöglicht es uns, die räumliche Verteilung verschiedener Moleküle wie Lipide, Zucker, Aminosäuren, Medikamente und deren Metaboliten innerhalb dieser Organoide abzubilden, ohne dass spezifische molekulare Sonden erforderlich sind. Qualitativ hochwertige MSI-Daten hängen von einer sorgfältigen Probenvorbereitung ab. Fixiermittel spielen eine zentrale Rolle, aber herkömmliche Optionen wie Glutaraldehyd, Paraformaldehyd und Kryokonservierung wie Saccharose können sich versehentlich auf die Gewebemetaboliten auswirken. Eine optimale Fixierung beinhaltet das Schockfrosten in flüssigem Stickstoff. Für kleine Organoide besteht der geeignetere Ansatz jedoch darin, die Organoide direkt aus dem Inkubator in eine erwärmte Einbettlösung zu überführen und anschließend in trockeneisgekühltem Ethanol einzufrieren. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Einbettung vor der Kryosektion, die ebenfalls MSI-kompatible Materialien erfordert, da herkömmliche Optionen die Matrixabscheidung und Ionisation beeinträchtigen können. Hier wird ein optimiertes Protokoll für hochauflösende MALDI-MSI von menschlichen Hirnorganoiden vorgestellt, das die Probenvorbereitung, Schnittbildung und Bildgebung mittels Massenspektrometrie umfasst. Diese Methode zeigt die molekulare Verteilung von kleinen Metaboliten, wie z. B. Aminosäuren, mit hoher Massengenauigkeit und Sensitivität. In Verbindung mit ergänzenden Studien von Gehirnorganoiden kann es dazu beitragen, komplexe Prozesse zu beleuchten, die die frühe Gehirnentwicklung, das Schicksal von Stoffwechselzellen und unterschiedliche Metabolitensignaturen steuern. Darüber hinaus bietet es Einblicke in die genauen Positionen von Molekülen innerhalb des Organoids und bereichert unser Verständnis der räumlichen Organisation von 3D-Gehirn-Organoidmodellen. Mit der Weiterentwicklung des Feldes wird eine wachsende Anzahl von Studien erwartet, die MSI nutzen, um sich mit Gehirnorganoiden und komplexen biologischen Systemen zu befassen und dadurch das Verständnis der metabolischen Aspekte der menschlichen Gehirnfunktion und -entwicklung zu vertiefen.

Einleitung

Organoide Modelle, die aus primären Gewebestammzellen, embryonalen Stammzellen oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)^1,2,3 gewonnen werden, haben die humanbiologische Forschung vorangetrieben, indem sie dreidimensionale Modelle anbieten, die organspezifische Funktionen genau nachahmen und die Erforschung der menschlichen Entwicklung, der Krankheitsmechanismen und der Arzneimittelforschung unterstützen ^4,5. In diesem Zusammenhang ist die Entschlüsselung der Komplexität von Hirnorganoiden von entscheidender Bedeutung für das Verständnis sowohl der physiologischen als auch der pathologischen Gehirnentwicklung ^6,7 und erfordert Technologien wie die massenspektrometrische Bildgebung (MSI)^8,9. MSI, die sich von der herkömmlichen Massenspektrometrie unterscheidet, ermöglicht die direkte, markierungsfreie Kartierung von Hunderten bis Tausenden von Biomolekülen innerhalb eines einzigen Gewebeschnitts und bietet detaillierte Einblicke in die räumliche Verteilung von Molekülen wie Lipiden, Peptiden, Aminosäuren, Arzneimitteln und deren Metaboliten, ohne dass spezifische molekulare Sonden erforderlich sind^10,11. Darüber hinaus können molekulare MSI-Bilder auf histologischen und immungefärbten Schnitten mitregistriert werden, was einen umfassenden Überblick über die Gewebemorphologie, die Zellspezifität und den molekularen Gehalt bietet.

Das MSI ist vielversprechend für die Organoidforschung und bietet Einblicke in die molekularen Grundlagen von Krankheiten, genetische Phänotyp-Beziehungen und Reaktionen auf Umweltreize ^12,13,14,15. In der pharmazeutischen Industrie erleichtert MSI die Analyse der Absorption, Verteilung, des Metabolismus und der Elimination von Arzneimitteln in präklinischen Modellen^11,16. Darüber hinaus hilft es bei der Auflösung ihrer biotransformierten Metaboliten, die pharmakologisch aktiv sein können¹⁷.

Unter den MSI-Methoden überwiegen die matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI), die Desorptions-Elektrospray-Ionisation (DESI) und die Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS) 9,18,19,20,21. Von diesen zeichnet sich MALDI-MSI durch seine Vielseitigkeit, seinen großen Massenbereich, seine direkten Analysemöglichkeiten und seine Kompatibilität mit verschiedenen gewebespezifischen chemischen Verbindungen^{aus 22}. Trotz seines Potenzials ist die Anwendung von MALDI-MSI in der Hirnorganoidforschung jedoch noch wenig erforscht. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein maßgeschneidertes Protokoll für die hochauflösende MALDI-MSI-Analyse (HR-MALDI-MSI) von Gehirnorganoiden eingeführt, um die Gewebekonservierung, die Matrixauswahl und die Bildgebungsbedingungen zu optimieren und eine zuverlässige Erfassung hochwertiger Daten zu gewährleisten¹⁵. Dieses detaillierte Protokoll zeigt die Fähigkeiten von HR-MALDI-MSI, Forschern das zusätzliche Arsenal an die Hand zu geben, um die Leistungsfähigkeit dieser Technologie zu nutzen, um die metabolische Landschaft von Organoiden in bisher unerreichter Detailgenauigkeit zu untersuchen.

Protokoll

Der allgemeine Überlauf des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Gehirn-Organoid-Schnitts

1. Präparation von Hirnorganoiden (2-3 mm groß, wenn sie 30-60 Tage in Kultur erreichen) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gemäß zuvor veröffentlichten Berichten ^23,24 und Entnahme zu einem gewünschten Zeitpunkt mit Spitzen mit breiter Bohrung.
   1. Waschen Sie die vorbereiteten Organoide dreimal mit 1x Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) ohne CaCl₂ und MgCl₂ bei Raumtemperatur, um das Medium zu spülen, und dann sehr schnell mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, um eventuelle Salze aus dem DPBS zu spülen.
2. Bereiten Sie 10 % Gelatinelösung aus kalter Fischhaut vor, indem Sie die Gelatine (10 mg in 100 ml DPBS) 2 Stunden lang bei 70-80 °C umrühren und erhitzen, dann die Lösung für 30 Minuten in einen 37 °C-Inkubator bringen, um Blasen zu entfernen und sich an die Temperatur des Inkubators anzupassen, in dem die Organoide gezüchtet wurden.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, Gelatine für jedes Experiment frisch zuzubereiten, aber sie kann bei Bedarf bis zu 1 Woche lang verwendet werden (bei 4 °C lagern). Gelatine verfestigt sich bei Raumtemperatur und muss vor der Verwendung als Einbettlösung erwärmt werden, um flüssig zu werden.
3. Stecken Sie das Organoid mit der kleinen Pipettenspitze in die Mitte einer Kunststoffform (25 mm x 20 mm x 5 mm) und gießen Sie die 10%ige Gelatine-Einbettlösung vorsichtig in die Form, bis das Organoid vollständig eingetaucht ist (die Form sollte etwa zur Hälfte gefüllt sein).
   1. Legen Sie die Form in eine Petrischale auf Trockeneis mit kaltem 100%igem Ethanol, um sie schnell einzufrieren (1-2 min). Wenn er vollständig gefroren ist, was sich in der Farbveränderung zu festem Weiß zeigt, nehmen Sie den Organoid-Gelatine-Block aus der Petrischale, wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie ein oder legen Sie ihn in einen Blechbecher, der verschlossen ist, um Wasserkonzentrationen zu verhindern, und lagern Sie ihn bei -80 °C, bis er zur Kryosektion bereit ist.
4. Für die Kryosektion werden die Kunststoffblöcke mit Organoiden 10-15 Minuten lang bei -20 °C bis -25 °C in der Kryokammer platziert, um sie mit der Kammertemperatur auszugleichen. Teilen Sie die Organoide mit Kryotom in 14-μm-Schnitte und tauen Sie sie auf Indiumzinnoxid-beschichtete Glasobjektträger (ITO-Objektträger) für MSI auf.
5. Strukturgleichmäßige Schnitte werden entweder sofort im Massenspektrometer gescannt oder im Behälter versiegelt und für spätere Untersuchungen bei -80°C gelagert.

2. Matrizenvorbereitung und Applikation für MALDI-MSI

1. Für MALDI-MSI besprühen Sie die Objektträger und beschichten Sie die Gewebeschnitte mit der Matrix, einer organischen Verbindung, die zur Ionisierung verschiedener Metaboliten beiträgt²⁵. Unterschiedliche Matrices werden verwendet, um verschiedene Arten von Molekülen abzubilden; Daher muss zunächst die für die Studie am besten geeignete Matrix ausgewählt werden.
   HINWEIS: Diese Studie konzentrierte sich auf die Lokalisierung und Verteilung von kleinen Metaboliten und Aminosäuren, die mit mitochondrialen Stoffwechselwegen in Verbindung stehen, und die Matrix wurde entsprechend ausgewählt (zur Kartierung von Lipiden siehe Cappuccio et al.)¹⁵. Datenschutz
2. Nachdem Sie die ITO-Objektträger aus -80 °C herausgenommen haben, legen Sie den Objektträger sofort für 20 Minuten in einen Exsikkator, um die Kondensation von atmosphärischem Wasser auf den Oberflächen zu minimieren.
3. Bereiten Sie N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-Dihydrochlorid (NEFZ) vor, das eine geeignete Matrix für kleine Metaboliten ist, da es ein starkes Signal des interessierenden Analyten liefert, ohne die Hintergrundsignale unter der m/z von 500 Da²⁶ zu beeinträchtigen. 10 mg/ml NEFZ-Lösung in 70%igem Methanol werden nach der Objektträgertrocknung mit einem beheizten pneumatischen Sprühgerät auf die Organoidabschnitte gesprüht.
4. Stellen Sie die Parameter des Matrixsprühers wie folgt ein: Düsentemperatur = 75 °C, Düsengeschwindigkeit = 1.250 mm/min, Pumpendurchfluss = 100 μL/min, Anzahl der Durchgänge = 8, Bahnabstand = 2,5 mm, Gasdurchfluss 3 l/min, Trocknungszeit = 10 s und 10 psi Stickstoffgasdruck.

3. MALDI-MSI-Instrumentierung

1. Um eine hochauflösende MALDI-MSI-Plattform zur Visualisierung von Organoid-Metaboliten im Gehirn zu erhalten, wird eine MALDI-Ionenquelle mit einer Dual-Ionen-Trichterschnittstelle an ein Massenspektrometer angeschlossen.
2. Verwenden Sie einen angeschlossenen, gütegeschalteten, frequenzverdreifachten Nd-Laser mit einer Wellenlänge von 349 nm, einer Wiederholrate von 1 kHz und einer Pulsenergie von ca. 1,3-1,4 μJ.
3. Um Oversampling zu vermeiden, fokussieren Sie den Laser auf eine Spotgröße von ~15 μm Durchmesser.
4. Befestigen Sie die Probe an der MALDI-Injektorstufe. Betreiben und warten Sie den Hochdruck-Ionentrichter bei 7,4-7,5 Torr, und halten Sie den Niederdruck-Ionentrichter bei 1,6-1,8 Torr.
5. Wenden Sie Hochfrequenzspannungen von 604 kHz, 80 V0-Spitze und 780 kHz, 191 V0-Spitze an die Hoch- bzw. Niederdruck-Ionentrichter an.
6. Um die Empfindlichkeit für kleine Metaboliten im niedrigen Massenbereich zu verbessern, reduzieren Sie die HF-Amplituden im Nieder- und Hochdrucktrichter der MALDI-MSI-Quelle auf etwa 20 % bzw. 15 %.
7. Legen Sie die Massenauflösung auf 70.000 fest. Wählen Sie den Bereich und die Pixelgröße (25 μm/Pixel) aus, die in der MALDI-Injektorsoftware gemessen werden sollen.

4. MALDI-MSI Datenerfassung und Datenanalyse

1. Erfassen Sie Daten im m/z-Bereich von 80-900 sowohl im negativen als auch im positiven Ionenmodus. Scannen Sie die Proben mit einer lateralen Auflösung von 25 μm pro Pixel für 14 μm Organoidschnitte.
2. Stellen Sie die Ioneninjektionszeit am Massenspektrometer auf 250 ms ein und erfassen Sie Fourier-Transformations-Massenspektren (FTMS) im Profilmodus, während die automatische Verstärkungsregelung (AGC) ausgeschaltet ist²⁶.
3. Verwenden Sie die NEFZ-Matrix-Peaks als interne Online-Massenkalibrierung, was zu einer Massengenauigkeit von besser als ±5 ppm führt.
4. Verwenden Sie kompatible Software, um die Daten zu verarbeiten. Importieren Sie die MSI-Spektraldaten direkt in die Software, führen Sie dann eine Basislinienkorrektur mit einem Faltungsalgorithmus durch und normalisieren Sie die Daten mit der Gesamtionenzahl (TIC).
5. Generieren Sie die Merkmalsliste von Ionenbildern aus den Rohdatendateien mit einer Bin-Breite von Δm/z = 0,01 oder ±5 ppm, um m/z-Bilder basierend auf Massendefekt und Pixelabdeckung zu unterscheiden.
6. Erzeugen Sie Falschfarben- (Jet) oder RGB- (rot-grün und blau) Bilder von einzelnen Metaboliten-Ionenspezies. Laden Sie die m/z-Liste der von MALDI-MSI erhaltenen Rohdatendateien in die Human Metabolome Database (HMDB) hoch (Massentoleranz <5 ppm relativ zur theoretischen m/z), um Metaboliten zu identifizieren.
   HINWEIS: Die genaue Masse und die vorhergesagte Formel und Struktur des Metaboliten, die aus den LC-MS/MS-Daten gewonnen wurden, werden auch verwendet, um Metabolomik-Datenbanken (z. B. HMDB, Metlin) zum Vergleich und zur Identifizierung von Metaboliten abzufragen.

Ergebnisse

Hier ist ein Protokoll, das die molekulare (metabolische) Bildgebung mit MSI optimiert (Abbildung 1, siehe auch Cappuccio et al.)¹⁵. Die zuverlässigste Konservierung der Daten und der Gewebemorphologie wurde mit 10 % Gelatine aus kalter Fischhaut erreicht, was durch histologische Färbung von Serienschnitten bestätigt wurde. Unter Verwendung der Fischgelatine-Einbettung von 60 Tage alten menschlichen Gehirnorganoiden wurden die Krebszyklus-bezogenen Metaboliten mittels MSI kartiert, um ihre räumliche Verteilung zu demonstrieren (Abbildung 2).

Insgesamt lieferte das optimierte Protokoll durchweg robuste Ergebnisse, wobei 10 % Gelatine aus kalter Fischhaut als bevorzugtes Einbettungsmaterial verwendet wurden und die NEFZ-Matrix-Sprüheinstellungen fein abgestimmt wurden, um die Bildauflösung zu verbessern. Die nachgewiesenen kleinen Metaboliten in Hirnorganoiden liefern wertvolle Einblicke in die molekulare Komplexität dieses Gewebes.

Abbildung 1: Allgemeine Pipeline der Studie zum Metabolom von Organoiden im menschlichen Gehirn. Organoide, die über induzierte pluripotente Stammzellen aus den Fibroblasten des Individuums gewonnen werden, werden für LC-MS und MSI verwendet, um die räumliche Verteilung der Metaboliten hervorzuheben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Kartierung von Metaboliten, die mit dem Krebszyklus in Verbindung stehen. Identifizierung und Verteilung von Metaboliten, die mit dem Krebszyklus in Verbindung stehen, unter Verwendung von 60-Tage-Organoiden, die von gesunden Kontrollen unter Verwendung von MSI stammen. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das verfeinerte Protokoll für hochauflösende MALDI-MSI von menschlichen Gehirnorganoiden befasst sich akribisch mit entscheidenden Schritten, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Die Konservierung der Proben erweist sich als von größter Bedeutung, und um Geweberisse und -beschädigungen zu vermeiden, wird eine alternative Einfriermethode vorgeschlagen, bei der eine erwärmte Einbettungslösung und trockeneisgekühltes Ethanol zum Einsatz kommen. Dieses Protokoll funktioniert am besten für Gewebe von winziger Größe, wie z. B. Organoide des menschlichen Gehirns¹⁵. Vor Einbettungsmaterialien wie OCT-Verbindung (Optimal Cutting Temperature) und Formalin-fixierte Paraffineinbettung (FFPE) wird aufgrund ihrer Interferenz mit der Matrixabscheidung und Ionisation gewarnt. Stattdessen wird 10 % Gelatine aus kalter Fischhaut als optimale Einbettungslösung hervorgehoben, was ihre Wirksamkeit bei der Erhaltung der Gewebeintegrität während des Kryoschnitts demonstriert¹⁵. Darüber hinaus ist die Wahl der Matrix und ihrer Abscheidungstechniken, wie z. B. Trockensprühen, unerlässlich, um die Delokalisierung von kleinen Metaboliten mit niedrigem m/z zu minimieren und die Bildauflösung zu verbessern.

Die Robustheit und Zuverlässigkeit des Protokolls wird durch die erfolgreiche Detektion und Visualisierung eines breiten Spektrums von Molekülen in menschlichen Gehirnorganoiden¹⁵ untermauert, was unschätzbare Einblicke in ihre räumliche Verteilung und potenzielle biologische Bedeutung liefert. Diese Ergebnisse erweitern das Verständnis der komplizierten molekularen Landschaft innerhalb von Gehirnorganoiden erheblich und klären zentrale Signalwege und Stoffwechselprozesse auf, die der Entwicklung und Funktion des Gehirns zugrunde liegen.

Während die aktuellen Daten neue Einblicke in die Lokalisierung verschiedener Spezies liefern, hat die in dieser Studie verwendete Spektrogramm-MALDI-Bildgebungsquelle noch keine Auflösung auf Einzelzellebene erreicht (derzeit bei ~10-20 μm). Andere Plattformen, wie z. B. timsTOF von Bruker und MRT von Water, können eine Einzelzellauflösung von 5 μm liefern, und daher ist es wichtig, das für Experimente zu verwendende Instrument im Auge zu behalten.

Trotz dieser Einschränkungen ist die hochauflösende HR-MALDI-MSI von Hirnorganoiden vielversprechend. Die Fähigkeit, Metaboliten- und Lipidverteilungen innerhalb von Organoiden zu kartieren, bietet einen einzigartigen Punkt über das Schicksal von Stoffwechselzellen, Signalwege und unterschiedliche Signaturen, die für die Entwicklung und Reifung von Organoiden entscheidend sind. Diese Methodik dient als Brücke zwischen konventioneller Histologie und molekularer Analyse und ermöglicht ein tieferes Verständnis der Zusammenhänge zwischen Genom, Phänomen und Umweltreaktionen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das optimierte Protokoll für HR-MALDI-MSI von menschlichen Gehirnorganoiden eine wertvolle Bereicherung für Forscher darstellt, die Organoidmodelle erforschen. Diese Methode legt den Grundstein für die weitere Aufklärung der molekularen Feinheiten, die der Entwicklung und Funktion des Gehirns zugrunde liegen, indem sie kritische Schritte akribisch anspricht, Fehler betreibt und Einschränkungen anerkennt. Da sich die MSI-Technologie weiterentwickelt und zunehmend zugänglich wird, ist sie bereit, unser Verständnis der frühen menschlichen Entwicklung, der Krankheitsmodellierung und der Arzneimittelforschung zu verbessern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)