Assemblierung von Netzhaut-Organoiden mit Mikroglia

Zusammenfassung

Mikroglia sind einzigartige residente Immunzellen in der Netzhaut, die eine entscheidende Rolle bei verschiedenen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut spielen. Die Generierung eines Co-Kulturmodells von retinalen Organoiden mit Mikroglia kann ein besseres Verständnis der Pathogenese und des Entwicklungsfortschritts von Netzhauterkrankungen ermöglichen.

Zusammenfassung

Aufgrund der eingeschränkten Zugänglichkeit der menschlichen Netzhaut sind retinale Organoide (ROs) das beste Modell für die Untersuchung menschlicher Netzhauterkrankungen, das den Mechanismus der Netzhautentwicklung und das Auftreten von Netzhauterkrankungen aufdecken könnte. Mikroglia (MG) sind einzigartige residente Makrophagen in der Netzhaut und im Zentralnervensystem (ZNS), die wichtige Immunfunktionen erfüllen. Retinalen Organoiden fehlen jedoch Mikroglia, da ihr Differenzierungsursprung der Dottersack ist. Die spezifische Pathogenese von Mikroglia bei diesen Netzhauterkrankungen ist noch unklar; Daher erweist sich die Etablierung eines Mikroglia-eingebauten retinalen Organoidmodells als notwendig. Hier ist es uns gelungen, ein co-kultiviertes Modell von Netzhaut-Organoiden mit Mikroglia zu konstruieren, die aus menschlichen Stammzellen gewonnen wurden. In diesem Artikel haben wir Mikroglia differenziert und dann im Frühstadium zu retinalen Organoiden cokultiviert. Als Integration von Immunzellen bietet dieses Modell eine optimierte Plattform für die Modellierung von Netzhauterkrankungen und das Wirkstoffscreening, um eine eingehende Erforschung der Pathogenese und Behandlung von Netzhaut- und ZNS-bedingten Erkrankungen zu ermöglichen.

Einleitung

Die Differenzierung menschlicher Stammzellen in dreidimensionale (3D) Netzhautorganoide stellt als begrenzte Quelle der menschlichen Netzhaut ein vielversprechendes in vitro Modell zur Simulation der Netzhaut^{dar 1}. Es enthält verschiedene Zelltypen in der Netzhaut, darunter Photorezeptoren, retinale Ganglienzellen, bipolare Zellen, Müller-Zellen, horizontale Zellen und Astrozyten². Dieses Modell ermöglicht die Emulation und Untersuchung sowohl der Entwicklungsmechanismen der Netzhaut als auch der Pathogenese von Netzhauterkrankungen. Aufgrund der gerichteten Differenzierungsmethode wurden jedoch retinale Organoi....

Protokoll

Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission des Beijing Tongren Hospital der Capital Medical University genehmigt. Die HESC-Zelllinie H9 stammt aus dem WiCell Research Institute. Erwärmen Sie das Zellkulturmedium vor dem Experiment 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).

1. Erzeugung menschlicher Mikroglia

1. Kultivieren Sie die hES-Zellen in Stammzellmedium, bis die Zelldichte 80%-90% erreicht. Säen Sie mindestens 1 x 10⁶ Zellen in jede Vertiefung.
2. Aspirieren Sie das Stammzellmedium und spülen Sie die Zellen mit 1x DPBS (1 mL/Well oder 6-Well-Platte). Für den nächsten Schritt we....

Diskussion

Aufgrund der eingeschränkten Verfügbarkeit der menschlichen Netzhaut stammt unser heutiges Verständnis von retinalen Entzündungsreaktionen fast aus Tiermodellen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden retinale Organoide differenziert. Die Entwicklung von Netzhaut-Organoidmodellen ist ein aktives Forschungsgebiet, das darauf abzielt, die Komplexität der menschlichen Netzhaut für die Modellierung von Krankheiten und die therapeutische Entwicklung zu rekapitulieren. Mehrere Studien haben über die erfolgreiche.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023