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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Messung von Husten mit einem nicht-invasiven und Echtzeit-Ganzkörperplethysmographie-System (WBP) und die normativen Verfahren zur Entnahme von Gewebeproben von Mäusen und stellen einige Methoden zur Beurteilung von Atemwegsentzündungen vor.

Zusammenfassung

Chronischer Husten, der länger als 8 Wochen anhält, ist eine der häufigsten Beschwerden, die ärztliche Hilfe erfordern, und die Patienten leiden unter einer enormen sozioökonomischen Belastung und einer deutlichen Verschlechterung der Lebensqualität. Tiermodelle können die komplexe Pathophysiologie des Hustens nachahmen und sind wichtige Werkzeuge für die Hustenforschung. Die Detektion der Hustenempfindlichkeit und der Atemwegsentzündung ist von großer Bedeutung für die Erforschung des komplexen pathologischen Mechanismus des Hustens. Dieser Artikel beschreibt die Messung von Husten mit einem nicht-invasiven und Echtzeit-Ganzkörperplethysmographie-System (WBP) und die normativen Verfahren zur Entnahme von Gewebeproben (einschließlich Blut, Lunge, Milz und Luftröhre) von Mäusen. Es werden einige Methoden zur Beurteilung von Atemwegsentzündungen vorgestellt, einschließlich pathologischer Veränderungen in Hämatoxylin- und Eosin (HE)-gefärbten Lungen- und Luftröhrenschnitten, der Gesamtproteinkonzentration, der Harnsäurekonzentration und der Aktivität der Laktatdehydrogenase (LDH) im Überstand der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) sowie der Leukozyten und der differentiellen Zellzahlen von BALF. Diese Methoden sind reproduzierbar und dienen als wertvolle Werkzeuge, um die komplexe Pathophysiologie des Hustens zu untersuchen.

Einleitung

Husten ist ein wichtiges Abwehrverhalten, um die Durchgängigkeit der Atemwege aufrechtzuerhalten und die Lunge vor potenziell schädlichen Substanzen zu schützen. Wenn Husten jedoch dysreguliert ist, wird er zu einem pathologischen Zustand1. Chronischer Husten, der in der Regel acht oder mehr Wochen andauert, ist eines der häufigsten Symptome, die ärztliche Hilfe erfordern2. Da chronischer Husten häufig über Jahre anhält, leiden die Patienten unter einer enormen sozioökonomischen Belastung und einer deutlichen Verschlechterung der Lebensqualität 3,4,5. Chronischer Husten wird weithin als Hustenüberempfindlichkeitssyndrom angesehen und ist durch lästigen Husten gekennzeichnet, der oft durch geringe thermische, mechanische oder chemische Exposition ausgelöst wird6. Das Auftreten einer Hustenüberempfindlichkeit steht in engem Zusammenhang mit einer Entzündung der Atemwege7. Die pathophysiologischen Mechanismen, die der Modulation der Hustenempfindlichkeit zugrunde liegen, müssen jedoch weiter aufgeklärt werden.

Tiermodelle können die komplexe Pathophysiologie des Hustens nachahmen und sind wichtige Werkzeuge für die Hustenforschung 8,9. Frühere Studien haben ergeben, dass eine Virusinfektion, intrapulmonale Interferon-γ (IFN-γ)-Instillation, die Perfusion von Salzsäure in der Speiseröhre, die Exposition gegenüber Schadstoffen, Zigarettenrauch und Zitronensäure bei Tieren Husten auslösen können10,11,12,13,14,15,16,17. Um Husten und Atemwegsentzündungen besser beurteilen zu können, wurde in dieser Studie ein Mausmodell für Husten mit einer nicht-letalen Dosis des H1N1-Virus etabliert. Für die Erkennung von Husten wurden klinisch einige Hustenmessinstrumente zur Messung von Husten etabliert, darunter subjektive und objektive Methoden18. Zu den subjektiven Bewertungsinstrumenten zur Beurteilung des Schweregrads des Hustens gehören in erster Linie eine visuelle Analogskala, der Husten-Score und Fragebögen zur Lebensqualität usw.19,20. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass sie zur Beurteilung von Husten bei Tieren verwendet werden. Darüber hinaus kann Husten durch einen Hustenprovokationstest und eine Überwachung der Hustenhäufigkeit objektiv beurteilt werden. Der Hustenprovokationstest mit einem Ganzkörperplethysmographie-System (WBP) ist eine objektive Methode, die in Tierversuchen weit verbreitet ist, um die Hustenempfindlichkeit zu messen und die zugrunde liegenden Mechanismen des Hustens aufzudecken13,16. Aufgrund der neuroanatomischen Eigenschaften des Hustenreflexes werden häufig Zitronensäure, Capsaicin, Adenosin-5'-Triphosphat (ATP), Allylisothiocyanat (AITC) und der Entzündungsmediator Bradykinin als tussive Mittel zur Induktion von Husten verwendet21,22. Zitronensäure ist eines der frühesten und am weitesten verbreiteten Tussivmittel, das Hustenreflexe auslöst und für die Messung der Hustenempfindlichkeit validiert wurde. Außerdem weist die Zitronensäure-Challenge eine gute Sicherheit, Machbarkeit und Verträglichkeit auf und wird empfohlen, um die Empfindlichkeit des Hustenreflexes als Reaktion auf Hustentherapien zu beurteilen23. Daher wird in diesem Artikel die Methode zur Messung der Hustenempfindlichkeit als Reaktion auf Zitronensäure bei Mäusen unter Verwendung eines nicht-invasiven Echtzeit-WBP-Systems beschrieben.

Für die Untersuchungen der Pathophysiologie des Hustens sind Testproben erforderlich, einschließlich Proben aus dem Blut, der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) sowie dem Lungen- und Luftröhrengewebe, um Veränderungen der Spiegel der Schlüsselfaktoren zu überprüfen24. Derzeit mangelt es an normativen Verfahren für die Entnahme von Gewebeproben von Mäusen, und verwandte Studien verwenden unterschiedliche Ansätze, die die Beurteilung von Atemwegsentzündungen erschweren. Die bronchoalveoläre Lavage ist eine wichtige Methode zur Beurteilung von Atemwegsentzündungen bei Atemwegserkrankungen25. Unterschiedliche Methoden der bronchoalveolären Lavage führen zu einer mangelnden Vergleichbarkeit zwischen verwandten Studien. Darüber hinaus haben verschiedene bronchoalveoläre Lavage-Methoden einen Einfluss auf Entzündungszellen und inflammatorische Zytokine bei BALF. Daher wird in diesem Artikel die Etablierung eines Mausmodells für Husten mit einer nicht-letalen Dosis des H1N1-Virus, die Messung von Husten mit einem WBP-System und eine zuverlässige, sichere und äußerst erfolgreiche bronchoalveoläre Lavage-Methode an Mäusen beschrieben.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Guangzhou Medical University (20240248) genehmigt und in strikter Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt. In dieser Studie wurden männliche spezifische, pathogenfreie C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Alle Mäuse wurden unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 °C), Luftfeuchtigkeit (50 % ± 20 %) und Beleuchtung (6:30 bis 18:30 Uhr) in festen Bodenkäfigen untergebracht, in denen Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung standen. Die Zeitachse des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Etablierung eines Mausmodells für Husten

  1. Verwenden Sie das Influenzavirus A/California/7/2009 (H1N1). Bestimmen Sie die letale Dosis des H1N1-Virus bei Mäusen.
    1. Kurz gesagt, betäuben Sie Mäuse (n = 10 pro Gruppe) mit Pentobarbital-Natrium (80 mg·kg-1) und infizieren Sie dann intranasal mit einem 10-fach seriell verdünnten Virus.
    2. Überwachen Sie den Tod über einen Zeitraum von 15 Tagen. Berechnen Sie die mediane letale Dosis (LD50) nach der Reed-Muench-Methode26.
  2. Infizieren Sie die Maus mit dem H1N1-Virus.
    1. Löse 0,8 xLD 50 des H1N1-Virus in 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    2. Betäuben Sie die Mäuse mit Pentobarbital-Natrium (80 mg·kg-1).
    3. Wenn die Mäuse tief betäubt waren, legen Sie die Maus in Rückenlage mit den Nasenlöchern nach oben.
    4. 5-10 μl H1N1-Viruslösung oder PBS-Lösung (als Kontrolle) intranasal in ein Nasenloch von Mäusen mit einer Pipette träufeln (Abbildung 2A).
    5. Halten Sie dann den Mund der Maus mit dem Daumen geschlossen, damit die Nase stark einatmet, so dass die H1N1-Viruslösung in der Nasenhöhle vollständig in die Lunge eingeatmet wird (Abbildung 2B).
    6. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4 und 1.2.5 in der anderen Nasenhöhle der Mäuse.
    7. Wenn alle in Schritt 1.2.1 hergestellten H1N1-Viren intranasal in die Lunge der Maus instilliert werden, legen Sie sie zur Ruhe in Rückenlage (Abbildung 2C).
  3. Messen Sie die Hustenempfindlichkeit der Maus nach der Modelletablierung mit dem Buxco Kleintier-Ganzkörperplethysmographie-System. Am Tag 21 wird die Maus intraperitoneal mit Pentobarbital-Natrium (150 mg·kg-1) anästhesiert. Sammeln und verarbeiten Sie Blut-, Milz-, BALF-, Lungen- und Luftröhrengewebe (Abbildung 1).

2. Die Messung der Hustenempfindlichkeit

  1. Zitronensäure (0,4 M) vorbereiten: Geben Sie 0,1537 mg Zitronensäure in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie normale Kochsalzlösung bis zu einem Volumen von 2 ml hinzu.
  2. Inspektion von Instrumenten
    1. Überprüfen Sie die Kanäle: Schließen Sie die Ganzkörper-Plethysmographenkammern gemäß den Anweisungen des Herstellers an und klicken Sie auf die Kalibrierungstaste – die Kalibrierungstaste wechselt von orange auf grün, um anzuzeigen, dass die Kalibrierung erfolgreich war (Abbildung 3A).
    2. Kalibrieren Sie den Vernebler:
      1. Nachdem Sie den Vernebler angeschlossen haben, geben Sie 500 μl normale Kochsalzlösung in den Vernebler und klicken Sie auf die Schaltfläche Vernebelung.
      2. Wenn die Flüssigkeit im Vernebler vollständig vernebelt ist, klicken Sie erneut auf die Vernebelungstaste, um die Leistung des Verneblers zu sehen, die in der Regel etwa 0,3 ml/min beträgt. Klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Vernebelung, um die aktuell vernebelte Leistung zu übernehmen.
    3. Stellen Sie nach der Überprüfung der Kanäle sicher, dass der Fehlerwert kleiner als 0,5 % ist.
  3. Parameter einstellen
    1. Klicken Sie auf Neue Studie erstellen, wählen Sie die Option Husten aus, wählen Sie Maus in Spezies aus und klicken Sie auf Weiter.
    2. Wählen Sie die CCnt-Parameter : Stellen Sie die Dauer der Eingewöhnungszeit auf 1 min, die Reaktionszeit auf 10 min, das Aerosolvolumen auf 1 mL und die Verabreichungsdauer auf 10 min ein.
    3. Platzieren Sie die bewusste, ungebundene Maus in einzelnen transparenten Ganzkörper-Plethysmographenkammern aus Kunststoff. Geben Sie das Gewicht und die Betreff-ID der Maus ein und klicken Sie auf Weiter.
    4. Geben Sie 1 ml Zitronensäurelösung (0,4 M) in den Vernebler und beobachten Sie Echtzeitänderungen des CCnt (Abbildung 3B).
    5. Nachdem die Zitronensäure vollständig aufgebraucht ist, klicken Sie auf Datei und Sitzung beenden , um das Experiment abzuschließen.

3. Entnahme von Blut-, Milz-, BALF-, Lungen- und Luftröhrengewebe von Mäusen (Abbildung 4)

  1. Sammle Blut.
    1. Nach der Hustenerkennung wird die Maus durch intraperitoneale Injektion mit Pentobarbital-Natrium (150 mg·kg-1) betäubt. Sammeln Sie Blut aus den Augenhöhlen der tief betäubten Maus. Mischen Sie 1 ml Blut mit 0,1 ml Antikoagulanzienpuffer (9,9 mg/ml Heparinnatrium, gelöst in PBS) bei 4 °C (Abbildung 4A).
    2. Schütteln Sie das Blutentnahmeröhrchen, um das Blut und das Antikoagulans vollständig zu vermischen, um eine Blutgerinnung zu verhindern.
    3. Das entnommene Blut bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand, lagern Sie ihn bei -80 °C (zur Messung von Zytokinen) und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL D-Hank-Lösung. Verteilen Sie 10 μl der Blutkörperchensuspension auf dem Objektträger, um Zellprofile zu bestimmen.
  2. Ernte die Milz.
    1. Öffnen Sie den Brustkorb der Maus, sammeln Sie das Blut und entbluten Sie über die Arterie (Abbildung 4B).
    2. Entfernen Sie die linke Ohrmuschel und perfundieren Sie dann den pulmonalen und systemischen Kreislauf mit 5 ml normaler Kochsalzlösung (Abbildung 4C, D). Entfernen Sie die gesamte Milz von der Maus mit einer chirurgischen Zange (Abbildung 4E).
    3. Nachdem du das Gewicht der Milz gemessen hast, schneide sie in zwei Hälften. Fixieren Sie die erste Hälfte mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) für die histopathologische Analyse. Lagern Sie die zweite Hälfte bei -80 °C für die Zytokinmessung.
  3. Bronchoalveoläre Lavage
    1. Stellen Sie das bronchoalveoläre Spülröhrchen mit einer Pasteurpipette her. Erhitzen Sie die Pasteur-Pipette mit einer Alkohollampe. Wenn es weich wird, verlängern Sie es, um eine dünne Röhre zu bilden. Die Länge der bronchoalveolären Lavageröhre beträgt 5 cm. Der obere Durchmesser beträgt 5 mm und der untere Durchmesser 1 mm (Abbildung 5).
    2. Für die BALF-Entnahme trennen Sie die rechte Lunge, indem Sie am rechten Hauptstammbronchus ligieren. Sammeln Sie das BALF aus der linken Lunge, indem Sie dreimal mit 0,5 ml PBS auf Eis vorgekühlt lavieren. Die Wiederfindungsrate von BALF liegt bei mehr als 80 % (Abbildung 4F).
    3. Das gesammelte BALF bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Gesamtproteinkonzentration, die Harnsäurekonzentration, die LDH-Aktivität und die Zytokinkonzentrationen.
      HINWEIS: Die Entzündungsmarker, einschließlich der Gesamtproteinkonzentration, der Harnsäurekonzentration und der LDH-Aktivität im BALF-Überstand, werden mit dem Assay-Kit gemäß den Herstellerrichtlinien24 nachgewiesen.
    4. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBS und zählen Sie die Leukozyten in BALF mit Hilfe eines Zählobjektträgers.
    5. Um Zellprofile durch Differenzialzählungen zu bestimmen, schmieren Sie 50 μl der Zellsuspension auf die Objektträger und lassen Sie sie trocknen.
    6. Fixieren Sie den Objektträger über Nacht mit 4% Paraformaldehyd und färben Sie ihn dann mit dem Hämatoxylin-Eosin (HE). Klassifizieren Sie mindestens 400 Zellen in Neutrophile, Makrophagen, Lymphozyten oder Eosinophile pro Objektträger.
  4. Entnahme von Lungen- und Luftröhrengewebe für die histopathologische Analyse
    1. Nach der BALF-Entnahme die Hälfte der rechten Lunge (Abbildung 4G) und der Luftröhre (Abbildung 4H) mit 4 % Paraformaldehyd bei RT für die histopathologische Analyse entfernen und fixieren. Die andere Hälfte bei -80 °C für Western Blotting, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) lagern.

Ergebnisse

Abbildung 6 zeigt repräsentative Bilder pathologischer Veränderungen der HE-gefärbten Lunge (Abbildung 6A,B), der Luftröhre (Abbildung 6C,D) und der Milz (Abbildung 6E,F). Eine H1N1-Virusinfektion führte zu entzündlichen Veränderungen in der Lunge von Mäusen, einschließlich Ödemen und vielen Lymphozyten und Neutrophileninfiltration. Eine H1N1-...

Diskussion

Einige chronisch refraktäre und postinfektiöse Husten sind häufige Erkrankungen, die mit einer Infektion mit Atemwegsviren verbunden sind27. Um die Hustenempfindlichkeit und die Entzündung der Atemwege besser beurteilen zu können, wurde in dieser Studie ein Mausmodell für Husten mit dem H1N1-Virus erstellt. Geeignete Maushustenmodelle sollten für andere Studien entsprechend dem Zweck der Studie ausgewählt werden. Die meisten früheren Studien verwendeten das Meerschweinchen als Tiermodell ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Guangzhou Science and Technology Planning Project (202002030151), das Großprojekt des Guangzhou National Laboratory (GZNL2024A02001) und den Zuschuss des State Key Laboratory of Respiratory Disease (SKLRD-Z-202202) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehyde BiosharpBL539A
Buxco Small Animal Whole Body Plethysmography System DSI—
Calcium-free and magnesium-free Hank’s Balanced Salt SolutionBeyotimeC0219
Citric acidSigma-AldrichC2404
Hematoxylin-EosinBASO BiotechnologyBA-4098
Heparin sodium Alfa AesarA16198
Influenza A/California/7/2009 (H1N1) virusATCCVR-1894
IsofluraneRWDR510-22
Lactate dehydrogenase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA020-2-2
Normal salineGuangzhou Zhongbo Biotechnology1234-1
Pasteur pipetNEST318415
Pentobarbital sodiumMerckP3761
Phosphate buffered saline MeilunbioMA0015
Total protein assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA045-3
Uric acid assay kitThermo Fisher ScientificA22181

Referenzen

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