Visualisierung der DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit Hilfe von zerebellären organotypischen Kulturen

Zusammenfassung

Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs) reagieren besonders empfindlich auf Defizite in der DNA-Schadensreaktion. Es wird ein Protokoll zur visuellen Bewertung der Dynamik der PC-Reaktion auf DNA-Schäden vorgestellt, das die Färbung proteingebundener Poly(ADP-Ribose)-Ketten in zerebellären organotypischen Kulturen beinhaltet.

Zusammenfassung

Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs) weisen ein einzigartiges Zusammenspiel aus hohen Stoffwechselraten, spezifischer Chromatinarchitektur und umfangreicher Transkriptionsaktivität auf, was sie besonders anfällig für DNA-Schäden macht. Dies erfordert eine effiziente DNA-Schadensantwort (DDR), um eine Kleinhirndegeneration zu verhindern, die oft durch PC-Dysfunktion oder -Verlust ausgelöst wird. Ein bemerkenswertes Beispiel ist das Genominstabilitätssyndrom, Ataxie-Teleangiektasien (A-T), das durch fortschreitende PC-Depletion und Kleinhirnverschlechterung gekennzeichnet ist. Die Untersuchung der DDR-Mechanismen bei PCs ist von entscheidender Bedeutung, um die Wege aufzuklären, die zu ihrer Degeneration bei solchen Erkrankungen führen. Die Komplexität der Isolierung und Kultivierung von PCs in vitro hat die Forschungsbemühungen jedoch lange Zeit behindert. Murine zerebelläre organotypische (Schnitt-)Kulturen bieten eine praktikable Alternative, da sie die in vivo Gewebeumgebung genau nachahmen. Dieses Modell ist jedoch auf DDR-Indikatoren beschränkt, die für mikroskopische Bildgebung zugänglich sind. Wir haben das organotypische Kulturprotokoll verfeinert und gezeigt, dass die Fluoreszenzbildgebung von proteingebundenen Poly(ADP-Ribose) (PAR)-Ketten, einem schnellen und frühen DDR-Indikator, die DDR-Dynamik in PCs innerhalb dieser Kulturen als Reaktion auf genotoxischen Stress effektiv aufdeckt.

Einleitung

Die Integrität der zellulären DNA ist ständig durch DNA-schädigende Wirkstoffe bedroht, vor allem durch metabolische Nebenprodukte wie reaktive Sauerstoffspezies, die täglich Zehntausende von DNA-Läsionen pro Zelle verursachen¹. Die dauerhafte Aufrechterhaltung der Genomstabilität ist für die zelluläre Homöostase essentiell ^2,3. Der Eckpfeiler dieser Aufrechterhaltung ist die DNA-Schadensantwort (DDR) - ein kompliziertes, geschichtetes Signalnetzwerk, das spezifische DNA-Reparaturwege initiiert und gleichzeitig viele andere zelluläre Prozesse

Protokoll

In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu Materialien, Geräten und Antikörpern. Tierversuche wurden nach der Genehmigung nach den ethischen Richtlinien der Ethikkommission der Universität Tel Aviv angewendet. Das Verfahren wird an 10 Tage alten Mäusewelpen durchgeführt, unabhängig von ihrem Geschlecht. Bei Bedarf wird die Genotypisierung am Vortag mit einer Schwanzbiopsie und Standardmethoden durchgeführt. Lösungen sind steril und werden bei 4 °C gelagert, sofern nicht anders angegeben; siehe Tabelle 1.

1. Vorbereitung der Kulturen

Diskussion

Allgemeine Bemerkungen
Der große Vorteil des organotypischen Kultursystems besteht darin, dass es Studien mit dem Kleinhirnrindengewebe ermöglicht und seine strukturelle Organisation für mehrere Wochen in der Kulturschale bewahrt. Dieses System ist nützlich für die Durchführung eingehender morphologischer Analysen von Purkinje-Zellen (PCs), einschließlich detaillierter Untersuchungen von dendritischen Dornen und ultrastrukturellen Merkmalen 52,53,54,55,56,57,58.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm Petri dish	Corning Inc.	3294
Acetone	Invitrogen	25030081
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
Adhesive microscope slides	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper	TED PELLA	Model TC752-1	Style Razor Blades
BME	GIBCO	41010-026 500ml.	No L-Glut
Cell culture inserts	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo.	02-015-1A
HBSS w/o phenol red	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red	Sartorius	02-015-1A
Horse serum	GIBCO	26050088	heat inactivated
Iris forceps	CellPath	GZX-0100-00A	130mm blunt serrated
Iris spatula	F.S.T	10092-12
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	41010026
Methanol	Sigma-Aldrich	322412-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	G5767
Microscope	Olympus
Mounting Medium without	GRIGENE. Ltd, Israel	K239320A
Paraquat	Sigma-Aldrich	856177-250MG	Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor	Tocris Bioscience, United Kingdom	PDD 00017273	light sensitive
Phosphate buffer	Biological Indo.	02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates	Corning incorporated	CLS3516
Spare Chopping Discs	TED PELLA	Model 10180-01
Tissue chopper	McIlwain	Model TC752	10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG	Invitrogen	A21206	1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien	Milliphore	MAB3402	1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB300	1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit
Anti-calbindin-D-28K	Swant	CB-38a	1:2000; primary ab; blocking
Anti-pan-ADP-ribose reagent	Milliphore	MABE1016	1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)	Cell signaling	4084	1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature