Eine schnelle Methode, um Bienen auf dem Feld einzusperren und sicher zu handhaben

Zusammenfassung

Wir demonstrieren eine erprobte Methode für den sicheren Umgang mit auf dem Feld gesammelten Bienen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Manipulation, Identifizierung, genetische Probenahme und Bestätigung von Pflanzen-Insekten-Interaktionen über Pollen, die während der Probenahme gesammelt werden. Dieser Ansatz ist leicht anpassbar und bietet ein kostengünstiges, nicht-tödliches Mittel zur Untersuchung seltener Insektengruppen.

Zusammenfassung

Die Verbesserung des Verständnisses der grundlegenden Biologie und Ökologie vieler bestäuberischer Insekten, insbesondere spezieller oder seltener Taxa, ist für viele Forscher eine Priorität. Daher besteht oft die Notwendigkeit, im Feld gesammelte Organismen vorübergehend auf nicht schädigende Weise einzuschließen, um Informationen zu gewinnen oder zusätzliche Studien zu unterstützen. Dieses Protokoll stellt eine gründlich getestete, schnelle und kostengünstige Feldmethode für den sicheren Umgang mit Bienen dar, die für den Naturschutz von Bedeutung sind und leicht auf spezifische Projektanforderungen zugeschnitten werden können, einschließlich der Identifizierung von Organismen, der Pollenentfernung, der Markierung und/oder der Entnahme von nicht-letalen Gewebeproben für die genetische Analyse. Diese Methodik kann als zusätzliche Option im Werkzeugkasten des Forschers dienen, die bei bestimmten Szenarien eingesetzt werden kann. Es wird erwartet, dass diese Methode sowohl für die Verwendung mit anderen Insektenarten als auch für Individuen mit unterschiedlichen Erfahrungen und Fähigkeiten angepasst werden kann. Es kann von großem Wert für Forscher sein, die spezialisierte Bienen untersuchen oder wirtsspezifische Studien durchführen. Die Datenerfassung, die durch dieses Protokoll ermöglicht wird, wird von unschätzbarem Wert sein, um Forschern dabei zu helfen, kritische Datenlücken für viele Bestäuberarten, Pflanzen-Bestäuber-Netzwerkstrukturen sowie Initiativen zum Schutz und Management von Bestäubern zu schließen.

Einleitung

Eine wachsende Zahl von Beweisen spricht für den Rückgang der Wildbienen- und anderen Bestäuberpopulationen und die damit einhergehenden Veränderungen der Bestäubergemeinschaft 1,2,3,4. Anhaltende Verluste bedrohen die eigentliche Dienstleistung der Insektenbestäubung, die für die Erhaltung der biologischen Vielfalt, die Funktion des Ökosystems und die landwirtschaftliche Produktion von entscheidender Bedeutung^{ist 5}. Darüber hinaus bestehen bei vielen Wildbienen, insbesondere bei seltenen Arten, erhebliche Wissenslücken, die angemessene Bewirtschaftungs- und Erhaltungsmaßnahmen behindern können ^6,7.

Um diese Datenmängel zu beheben, haben Forscher eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um Insektenbestäuber, die damit verbundene Lebensraumnutzung und ihre Blütenpräferenzen zu untersuchen. Während Pfannenfallen, Blauflügelfallen, Malaisefallen, Auflauffallen und das direkte Einfangen mit Handnetzen häufig verwendet werden, haben viele dieser Methoden erhebliche Nachteile 8,9,10,11. Häufig angewandte Methoden zur Identifizierung des Bestäubers können zum Tod des Organismus führen, unabhängig davon, ob die Probe in einer Laborumgebung (z. B. mit einem Mikroskop) identifiziert werden muss. Die Mortalität kann für viele Insektenstudien vertretbar und notwendig sein. Bei der Arbeit mit gefährdeten, seltenen oder wenig untersuchten Insekten, deren Populationsstatus begrenzt oder unsicher ist, müssen Forscher jedoch die Sterblichkeit, Verletzungen oder den Stress von Organismen verringern, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass sich dies negativ auf diese Insektenpopulationen auswirkt. Daher sollten bei der Arbeit mit gefährdeten Arten oder Arten, die leicht an ihren wichtigsten Unterscheidungsmerkmalen identifiziert werden können, nach Möglichkeit weniger destruktive Probenahmeansätze gewählt werden.

Zu den nicht-letalen Methoden, die für die Sammlung von genetischem Material von Bienen vorgeschlagen wurden, gehören die Sammlung von Kot, Exuvien¹² und Flügelspitzen¹³. Die Anwendung dieser Methoden bei Bienen, die auf dem Feld gesammelt wurden, kann jedoch aufgrund des Zeitaufwands und/oder möglicher Auswirkungen auf die Flügel unhaltbar sein, was sich negativ auf den Flug und andere Verhaltensweisen auswirkt. Es hat sich gezeigt, dass die teilweise Entfernung der Antennen die Überlebensrate der beprobten Euglossin-Bienen nicht beeinträchtigt¹⁴. Ebenso reduzierte die Probenahme des terminalen Teils der Fußwurzel des Mittelbeins die Überlebensrate von Bombus terrestris-Arbeiterinnen nicht signifikant¹⁵. Eine weitere nicht-letale Probenahmemethode besteht darin, Proteinrückstände zu sammeln, indem die Bienen vorübergehend in eine Pufferlösung getaucht und anschließend wieder freigesetzt^{werden 16}. Die Überlebensanalyse zeigte, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen puffergespülten und ungespülten Bienen gab. Es gibt Einschränkungen bei jeder Technik, die bei der Beantwortung spezifischer Forschungsfragen und allgemeiner Projektziele berücksichtigt werden sollten.

Eine genaue taxonomische Identifizierung von Organismen ist entscheidend für eine effektive Forschung. Für viele Bestäuber-Taxa von Insekten ist es jedoch extrem abhängig von der Art des Interesses und dem Wissens- und Erfahrungsstand des Forschers oder Beobachters. Während viele Bienenarten im Feld identifiziert werden können, kann es entscheidend sein, Beweise zu haben, die die Beobachtung unterstützen. Während die meisten Bestäuberstudien in der Regel Individuen als Beweismittel sammeln und aufbewahren, kann die Verwendung von Fotos und Videos sowie dreidimensionale Videografie unter Verwendung von Virtual Reality als Proxy zur Unterscheidung bestimmter Arten verwendet werden, ohne dass die Opfer der Individuen beobachtet werden müssen¹⁷. Die Unterscheidung zwischen einigen Arten kann besondere Aufmerksamkeit und Fotografien spezifischer morphologischer Merkmale erfordern; In diesen Situationen müssen die Organismen manipuliert und auf eine einzigartige Position beschränkt werden können, damit die komplexen Unterscheidungsmerkmale zuverlässig fotografiert werden können.

Das vorübergehende Einsperren von Bienen zur Identifizierung kann auf verschiedene Arten erfolgen, einschließlich der Kühlung der Probe und/oder der Verwendung von Kohlendioxid, um die Bienen zu verlangsamen^18,19. Diese Methoden können jedoch das Verhalten verändern, was dazu führt, dass behandelte Bienen langsamer wieder aktiv werden, was möglicherweise die Nahrungssuche und die Fitness des Organismus beeinträchtigt oder das Risiko von Raubtieren erhöht 20,21,22. Darüber hinaus verlängern solche Techniken letztendlich die Zeit, in der Organismen eingesperrt und gehandhabt werden. Dies wiederum erhöht den Stress des Organismus und die Verarbeitungszeit vor Ort. Sicherere und effizientere Methoden wären daher sehr wünschenswert.

In einer Reihe von Studien wurden die von Bienen oder anderen Quellen gesammelten Pollen verwendet, um die Präferenzen bei der Nahrungssuche besser zu verstehen, Pflanzen-Bestäuber-Interaktionsnetzwerke aufzubauen, Umweltkontaminationen (z. B. Pestizidrückstände) zu identifizieren und die Ernährungsökologie zu bewerten 23,24,25,26,27,28,29. Viele Bienen pflegen sich selbst, wenn sie in einem Behälter eingesperrt sind. Daher wurden nicht-letale Methoden zur Probenahme von Pollen^{verwendet 30} (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen). In Fällen, in denen keine Selbstpflege stattfindet, ermöglicht die Verwendung eines taktileren Behälters, wie z. B. der wiederverschließbaren Plastiktüten, die in diesem Protokoll verwendet werden, jedoch einen sanften Druck auf bestimmte Körperteile, so dass der Pollen mit der Plastiktüte in Kontakt kommt, was zu einer höheren Wahrscheinlichkeit führt, eine Pollenprobe zu erhalten, als bei der Verwendung herkömmlicher harter Behälter.

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das an drei gefährdeten Bienentaxa gut getestet wurde. Es ist zwar arbeitsintensiv, ermöglicht aber eine umfassende Datenerfassung von bestäubenden Insekten und minimiert gleichzeitig die Gefahr der Sterblichkeit für die einzelnen Organismen. Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, ein sicheres und effektives Mittel zum Fangen, Identifizieren und sicheren Freisetzen von Insekten bereitzustellen. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es viele der Einschränkungen des traditionellen Insektensammelns überwindet. Es bietet eine einfache Möglichkeit, Individuen zu markieren, nicht-letales genetisches Material zu sammeln und Pollenproben zu sammeln, während gleichzeitig die Handhabungszeit und der Stress für den Organismus minimiert werden. Während traditionelle Methoden zum Sammeln von Insekten viele Vorteile^{haben 31}, haben wir eine Alternative entwickelt, um einige ihrer Einschränkungen zu überwinden, damit Insekten zur Identifizierung eingesperrt werden können, bevor sie schnell und sicher freigelassen werden. Abhängig von den Projektzielen können auch zusätzliche Schritte unternommen werden, während die Biene eingesperrt ist, um andere wichtige Daten zu sammeln.

Protokoll

1. Vorbereitung der Feldsammlung

1. Bestätigung der Projektziele (z. B. Identifizierung von Organismen, genetische Gewebeprobenahme usw.).
2. Überprüfen Sie die Materialtabelle und sammeln Sie alle relevanten Elemente, die für die Projektziele spezifisch sind.
3. Stellen Sie sicher, dass alle digitalen Geräte (z. B. Smartphone, Kamera, GPS) vollständig aufgeladen sind und dass Ersatzbatterien geladen und verpackt sind.

2. Organismus einfangen und sichern

1. Notieren Sie Standortparameter, die bei der Ankunft im Feld von Interesse sind, einschließlich Datum, Startzeit, Feldstandort/Standort und alle anderen relevanten Informationen (z. B. Wetterbedingungen, dominante Bodendecker, blühende Pflanzen usw.), die möglicherweise benötigt werden (Abbildung 1).
2. Fangen Sie eine einzelne Biene von Interesse mit der entsprechenden Netztechnik. Verwenden Sie ein Handnetz über ein Insektennetz aus der Luft oder ein Kehrnetz, je nach Schwerpunktart.
   HINWEIS: Andere Fangtechniken, wie z. B. das Sammeln über ein Fläschchen/Zentrifugenröhrchen, können ebenfalls für den Insektenfang verwendet werden.
3. Beobachten Sie das Exemplar visuell durch den Netzbeutel, um festzustellen, ob es dem interessierenden Taxon ähnelt. Wenn nicht, lassen Sie die Probe sicher los und setzen Sie die Vermessung fort.
4. Wenn es sich bei der Probe um die Fokalart zu handeln scheint, sichern Sie die Probe im Netzbeutel, so dass sie nicht entweichen kann (z. B. indem Sie die Oberseite des Netzbeutels über den Rahmen legen, den Hals des Netzbeutels verdrehen/einengen oder auf andere Weise mögliche Ausgänge verschließen).
5. Entnehmen Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel und öffnen Sie den Probenbeutel.
6. Stellen Sie sicher, dass sich die Biene von Interesse in der Nähe der Spitze des Netzbeutels befindet.
7. Fassen Sie mit einer Hand den Netzbeutel direkt unter der Probe. Halten Sie den Netzbeutel so, dass die Spitze (an der Stelle, an der das Insekt eingeschlossen ist) nach oben ausgerichtet ist und die Netzöffnung (d. h. der Reifen) darunter hängt.
   HINWEIS: Die meisten Insekten sind phototroph und fliegen/kriechen, wenn sie eingesperrt sind, in der Regel dem Licht entgegen.
8. Führen Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel mit der anderen Hand (d. h. der Hand, die den Netzbeutel nicht hält) in die Netzöffnung und durch den Netzbeutel, bis er die Hand unmittelbar unter der Probe erreicht.
9. Lassen Sie den Griff der Hand vorsichtig los und schließen Sie die Probe gerade so weit ein, dass die Hand, die den wiederverschließbaren Probenbeutel hält, in den geschlossenen Bereich mit der Probe gelangen kann. Achten Sie darauf, wo sich die Probe innerhalb des begrenzten Bereichs befindet, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass sie gestochen wird, die Probe verletzt und entkommt.
10. Manipulieren Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel so, dass er sich weit genug öffnet, damit die Insektenprobe eindringen kann. Üben Sie dazu Druck auf beide Seiten des Siegels aus oder drehen Sie den Beutel mit Daumen und Mittelfinger unter das Siegel.
11. Positionieren Sie die wiederverschließbare Probenbeutelöffnung über der Probe und manövrieren Sie das Insekt vorsichtig in den Beutel. Da die meisten Insekten phototroph sind, richten Sie, wie bereits erwähnt, die Hand mit dem wiederverschließbaren Probenbeutel zur Sonne/zum Himmel aus, um die Bewegung der Probe in den Beutel zu erleichtern.
12. Sobald sich die Probe im Inneren befindet, verschließen Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel fest.
13. Nehmen Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel mit der Probe aus dem Insektennetz.
    HINWEIS: Da Insekten in versiegelten Beuteln schnell und tödlich überhitzen können, bewahren Sie die Probe bis zur Verarbeitung vor direkter Sonneneinstrahlung auf, idealerweise an einem schattigen Ort oder in einem isolierten Behälter, und begrenzen Sie die Verarbeitungszeit.

3. Identifizieren Sie den Organismus

1. Untersuchen Sie das Exemplar genau, um sicherzustellen, dass es sich um ein Taxon von Interesse handelt. Wenn es sich um eine andere Art handelt, lassen Sie sie sicher frei und setzen Sie die Untersuchung fort.
   HINWEIS: Um Schäden an der Probe zu vermeiden, üben Sie niemals direkten Druck auf das Insekt aus, während es sich im Beutel befindet. Die Proben können immobilisiert werden, indem sanfter Druck auf den Kunststoff ausgeübt wird oder indem der Umfang des Beutels gedehnt wird, um den Beutel um die Probe herum straff zu machen und so die Bewegung zu begrenzen.
2. Wenn die Identität der Art leicht und genau visuell bestätigt werden kann, nehmen Sie einen Fotogutschein mit (Abbildung 2). Notieren Sie alle zusätzlichen notwendigen Informationen über das Exemplar (z. B. Zeitpunkt der Aufnahme, spezifischer GPS-Standort, besuchte Pflanze, einzigartige Markierungen, Beobachtung von Größe oder Färbung, Verhalten vor der Aufnahme usw.).
3. Wenn bestimmte physische Merkmale zur Bestätigung der Identität inspiziert werden müssen, machen Sie detaillierte Makrofotos, auf denen diese Schlüsselmerkmale durch den wiederverschließbaren Probenbeutel hervorgehoben werden (Abbildung 2).
4. Wenn Fotos von ausreichender Qualität für die Unterscheidung von Merkmalen durch den Probenbeutel nicht erreichbar sind, legen Sie die Körperteile der Probe für eine genaue Inspektion frei, indem Sie eine der beiden nicht versiegelten Eckspitzen des Probenbeutels abschneiden (d. h. die Ecken, die miteinander vernäht oder nicht wiederverschließbar sind). Schneiden Sie z. B. ein kleines Loch, um nur den Kopf, den Bauch oder das Bein freizulegen (Abbildung 3A-C). Manipulieren Sie dazu die Probe so, dass sich der interessierende Körperteil zuerst in Richtung des Schnitt-/Ecklochs bewegt.
   HINWEIS: Die Größe und Position des in den Beutel geschnittenen Lochs und die Ausrichtung des Insekts müssen möglicherweise geändert werden, um das erforderliche Foto zu erhalten.
5. Nachdem die Identifizierung erfolgt ist, springen Sie zu den entsprechenden Abschnitten für nachfolgende und gewünschte Methoden. Siehe Abschnitt 4 für die Technik zur Entfernung von Antennensegmenten, Abschnitt 5 für die Insektenmarkierung und/oder Abschnitt 6 für die Entnahme von Pollenproben.

4. Gewinnung nicht-letaler genetischer Proben von Antennen

1. Schneiden Sie mit einer Schere eine der beiden nicht versiegelten Ecken (d. h. die Ecken, die miteinander vernäht oder nicht wiederverschließbar sind) des wiederverschließbaren Probenbeutels diagonal ab. Achten Sie darauf, dass der Schnitt minimal größer ist als die Breite des Bienenkopfes (Abbildung 4).
2. Manipulieren Sie die Probe so, dass sie sich kopfüber auf das Schnitt-/Eckloch zubewegt.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann angepasst werden, um andere Gewebeproben für die genetische Analyse zu entnehmen (z. B. ganzes Bein, Teilbein). Dementsprechend müssen möglicherweise die Größe und Position des in den Beutel geschnittenen Lochs und die Ausrichtung des Insekts geändert werden, um die erforderliche Probe zu erhalten.
3. Sobald der Kopf der Biene aus dem Beutel herausragt, üben Sie vorsichtig Druck auf den umgebenden Kunststoff aus, um ihn um das Insekt herum straff zu machen und die Bewegung einzuschränken (Abbildung 3A).
4. Wenn das Loch zu groß ist, rollen Sie den Beutel über sich selbst, um die Lochöffnung weiter einzuschränken und die Probe zu sichern. Wenn Sie sich über die geeignete Lochgröße nicht sicher sind, führen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 in einem Insektennetz oder Flugkäfig durch, um sicherzustellen, dass die Probe nicht vollständig entweicht. Verwenden Sie eine zusätzliche Tasche, wenn der ursprüngliche Eckschnitt zu groß ist.
5. Positionieren Sie den Beutel so, dass sich der Insektenkopf direkt über dem Auffangbehälter befindet (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen/Fläschchen mit Pufferlösung/Ethanol) und dass der Behälter für die genetische Probe entsprechend der eindeutigen Proben-ID gekennzeichnet ist, die allen anderen Probendaten entspricht (Abbildung 3D).
6. Schneiden Sie mit einer sauberen und sterilisierten Präparierschere einen Teil eines Antennensegments ab. Führen Sie eine Sichtprüfung des Behälters durch, um sicherzustellen, dass sich die Probe im Behälter befindet.
   HINWEIS: Beim Schneiden ist es hilfreich, über ein sauberes, sterilisiertes, helles Substrat (z. B. Kimwipe) zu arbeiten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe, wenn sie nicht in den Probenentnahmebehälter fällt, mit einer Pinzette mit minimalem Kontaminationsrisiko entnommen werden kann.
7. Befestigen Sie den Deckel des Behälters für die Entnahme von Gewebeproben und drehen Sie den Behälter so, dass die Probe in der Lösung (z. B. Pufferlösung/Ethanol) suspendiert ist.
8. Stellen Sie den Behälter für die Entnahme von Gewebeproben (mit der Antennenprobe) in einen sicheren Behälter, idealerweise an einen kühlen, schattigen Ort, der vor direkter Sonneneinstrahlung und/oder extremen Temperaturen geschützt ist, z. B. in einem Feldkühler.
9. Lassen Sie die Probe sicher in der Nähe des ursprünglichen Fangpunkts frei.
   HINWEIS: Die Probe kann auch vor der Freisetzung markiert werden (siehe Abschnitt 5), um sie im Falle einer erneuten Sichtung/Wiederaufnahme leicht als beprobt zu identifizieren.

5. Markierung des Organismus

1. Schneiden Sie mit der Probe im wiederverschließbaren Probenbeutel ein kleines Loch in die Mitte des Probenbeutels.
   HINWEIS: Diese Bohrung befindet sich zusätzlich zu der Bohrung, die in Abschnitt 4 erstellt wurde. Das Loch sollte nicht größer sein als die Fläche des Brustkorbs des Insekts. Die Position, an der das Loch geschnitten werden soll, kann je nach Größe des Insekts und dem gewünschten Markierungsbereich variieren.
2. Üben Sie auf beiden Seiten der Probe leichten Druck auf den Kunststoff aus und manövrieren Sie das Insekt so, dass sich der Thorax direkt unter dem Loch befindet (d. h. dass die Oberseite des Thorax durch den Beutel freiliegt). Fahren Sie mit leichtem Druck fort, um sicherzustellen, dass die Probe an Ort und Stelle bleibt (Abbildung 5A).
   HINWEIS: Andere Markierungsbereiche können für bestimmte Insekten besser geeignet sein (Abbildung 5B). Einige Benutzer finden es hilfreicher, das vorhandene Loch (aus Abschnitt 4) zu vergrößern und die Biene zu greifen, indem sie ihren Thorax festhalten, wenn sie herauskommt (Abbildung 5C). Dieser Ansatz kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, gestochen zu werden. Darüber hinaus können die Markierungsgeräte für Honigbienenköniginnen so modifiziert werden, dass sie Bienen einsperren und markieren, wenn dies für den Benutzer einfacher ist. Diese Methode erfordert jedoch eine Übertragung auf ein anderes Gerät und könnte Pollenproben kontaminieren.
3. Markieren Sie das Exemplar mit einem Farbmarkierstift (oder einem anderen Markierungsmaterial, das für das betreffende Taxon als geeignet erachtet wird) gemäß der vorgegebenen projektspezifischen Methodik.
   HINWEIS: Die Markierungsmethoden unterscheiden sich je nach Ziel und können einfach sein, um anzuzeigen, dass die Person gefangen wurde, oder komplex, um die Identifizierung von Personen zu ermöglichen (z. B. durch Verwendung einer eindeutigen Farbcodierung oder Musterung) (Abbildung 5C).
4. Halten Sie die Probe an Ort und Stelle, bis die aufgetragene Markierung ausreichend trocken ist.
5. Fotografieren Sie die markierte Person, um die einzigartige Färbung und Farbposition zu bestätigen.
   HINWEIS: Wiedergefangene Personen können einfach und schnell direkt durch den wiederverschließbaren Probenbeutel fotografiert werden (Abbildung 5D).
6. Lassen Sie die Probe sicher in der Nähe des ursprünglichen Fangpunkts frei.

6. Entnahme von Pollenproben

1. Wenn sich die Probe im wiederverschließbaren Probenbeutel befindet, untersuchen Sie sie sorgfältig auf sichtbare Pollen.
   HINWEIS: Da die Art und Menge des Pollens sehr unterschiedlich ist, sind Pollen manchmal mit bloßem Auge nicht auf der Probe sichtbar. Wenn die vorherigen Schritte bereits abgeschlossen sind, ist es möglich, dass sich Pollenreste der Probe bereits im Beutel befinden.
2. Wenn Pollen auf der Probe sichtbar sind, begrenzen Sie die Bewegung der Probe, indem Sie sanften Druck auf den Kunststoff auf beiden Seiten ausüben.
3. Reiben oder drücken Sie den Kunststoff mit einem Finger vorsichtig gegen Setae oder pollenhaltige Körperteile, um die Entfernung von Pollen zu erleichtern.
4. Wenn der Pollen auf der Probe nicht sichtbar ist, maximieren Sie den Kontakt zwischen der Probe und dem Kunststoff, um zu sehen, ob kleine Pollenreste aus dem Integument entfernt wurden.
5. Vergewissern Sie sich, wenn möglich, sichtbar, dass sich Pollen im wiederverschließbaren Probenbeutel befinden (Abbildung 4).
6. Lassen Sie die Probe sicher in der Nähe des ursprünglichen Fangpunkts frei.
7. Verschließen Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel mit der Pollenprobe fest.
   HINWEIS: Wenn ein Loch in den wiederverschließbaren Probenbeutel geschnitten wurde, sollte es in einen anderen wiederverschließbaren Probenbeutel gelegt werden, um eine Kontamination oder einen Pollenverlust zu vermeiden.
8. Beschriften Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel mit einer eindeutigen Proben-ID, die dem einzelnen Insekt entspricht, und anderen Daten (z. B. Insektenart-ID, Datum, Ort, Uhrzeit, Geschlecht, Blütenbesuchsaufzeichnung usw.).
9. Legen Sie den wiederverschließbaren Probenbeutel mit der Pollenprobe in einen sicheren Behälter, idealerweise an einen kühleren Ort, um ihn vor direkter Sonneneinstrahlung und/oder extremen Temperaturen zu schützen.
   HINWEIS: Befolgen Sie gegebenenfalls projektspezifische Protokolle für die feldbasierte Pollenkonservierung (z. B. genetische Analyse, Pollenmorphologie).

Ergebnisse

Diese Methode wurde für drei gefährdete Bienenarten (Osmia calaminthae, Caupolicana floridana und C. electa) im Südosten der Vereinigten Staaten angewendet. Bis heute wurden Hunderte von Bienen und Wespen sicher eingesammelt und wieder freigelassen. Bei dieser Methode starben keine Bienen; Diejenigen, die als Belegexemplare gekennzeichnet und als neuer Standortdatensatz bei der zuständigen Verwaltungsbehörde aufbewahrt wurden, wurden nach der Datenerhebung angemessen geopfert. Tabelle 1 zeigt verschiedene bewertete morphologische Merkmale sowie andere quantifizierbare Daten, die mit diesem Protokoll gesammelt werden können 14,32,33,34,35,36.

Abbildung 1: Beispieldatenblatt mit Daten, die vor Ort gesammelt werden können. Die spezifischen Daten, die erhoben werden, variieren je nach Projektzielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Fotos, die als Gutscheine dienen sollen. Das Fotografieren als Beleg für das Ereignis ist für die Berichterstattung unerlässlich. Fotos von eindeutigen Erkennungsmerkmalen sind erforderlich, wenn mehrere Arten ähnliche Merkmale aufweisen. Dieses Anthidium maculifrons , das in Florida vorkommt, kann von anderen der Gattung anhand des Gelbs auf seinem Fell und Kopf unterschieden werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Einsetzen des Lochs in den wiederverschließbaren Probenbeutel. Die Platzierung des Lochs in dem wiederverschließbaren Probenbeutel kann geändert werden, um bestimmte Körperteile von Interesse für Fotos oder genetische Proben freizulegen. Auf diesem zusammengesetzten Foto sind der Kopf der Biene, der Bauch (B) und das Bein (C) auf dem Foto zu sehen. Sobald die Biene eingesperrt ist und sich nicht mehr bewegen kann, ruht sie sich oft aus und kann positioniert werden, um ein Makrofoto zu machen. (D) Eine genetische Probe kann auch entnommen werden, wenn sich die Biene in diesen Positionen befindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Auffangsack mit Biene, bei der eine Ecke diagonal geschnitten ist. Wenn Sie den Kopf der Biene genau beobachten möchten, variiert die Größe des Schnitts an der Ecke des Beutels je nach Kopfgröße der Biene. Pollen und sogar Nektarsekrete können in dem Beutel gefunden werden, um die Pollen später zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Bilder eines wiederverschließbaren Probenbeutels mit Bienen. Um beim Markieren der Biene nicht gestochen zu werden, kann ein Loch in den Beutel gebohrt werden, und der Brustkorb (A) kann unter dem Loch positioniert werden. (B) Je nach Größe der Biene kann sie auch auf dem Bauch markiert werden. (C) Alternativ kann die Biene auch aus dem Eckloch gelöst und am Thorax zur Markierung zusammengedrückt werden. Diese Technik kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, gestochen zu werden, scheint aber das Verschmieren des Stifts zu minimieren. Einzigartige Farbgebung/Nummerierung kann verwendet werden, um zwischen Individuen zu unterscheiden. (D) Zukünftige wiedergefangene Proben können schnell und einfach durch den wiederverschließbaren Probenbeutel fotografiert und freigegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Morphologische Merkmale, die mit diesem Protokoll bewertet wurden. Die Proben können auch manipuliert werden, um zahlreiche Merkmale zu beobachten und zu dokumentieren, die in dieser Tabelle nicht dargestellt sind (z. B. Tergit-/Sternitform, Gesamtlänge, Gewicht, Anzahl der Zähne, Flügeladerung, intertegulärer Abstand usw.). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Feldmethode für den sicheren Umgang und die Inspektion seltener Bienen mit dem Endziel, die gewünschten nicht-tödlichen Proben- oder Beleginformationen zu erhalten und zentrale Individuen am ursprünglichen Fangpunkt sicher wieder in die Wildnis zu entlassen. Die Vorteile dieses Protokolls gegenüber anderen Entnahmemethoden, wie z. B. der Verwendung von Fläschchen, bestehen darin, dass die Probe sicher eingeschlossen werden kann, um eine genaue Untersuchung der wichtigsten Merkmale und eine sichere Identifizierung zu ermöglichen, wodurch der Schaden sowohl für das Insekt als auch für den Untersucher begrenzt wird. Umgekehrt erfordert dieses Protokoll, wie es bei anderen Methoden^{18, 19} der Fall ist, keine Anästhesie der Probe; Es kann schnell und mit minimalem Aufwand beprobt und freigegeben werden. Wiederverschließbare Probenbeutel sind kostengünstig, einfach zu beschaffen, leicht, extrem tragbar und recycelbar, was sie zu einer großartigen Alternative zu Zentrifugenröhrchen macht. Da ihnen die Steifigkeit einiger Alternativen (z. B. Falkenröhren oder andere harte Behälter) fehlt, ist es wichtig, beim Umgang mit lebenden Insekten besondere Vorsicht walten zu lassen. Wenn eine ganze Probe als Beleg entnommen werden soll, können Sie sie in ein stabiles Gehäuse legen, um mögliche Schäden an der Probe zu reduzieren.

Für Forscher, die diese Methode anwenden, ist es von Vorteil, Erfahrung im Umgang mit Bienen und/oder anderen Insekten zu haben, da zu viel Druck auf die Proben ausgeübt wird, während sie sich im Beutel befinden, zu Verletzungen oder zum Tod führen kann. Um mehr Erfahrung im Umgang mit Bienen zu sammeln, sollten unerfahrene Forscher dieses Protokoll mit häufigeren Arten (z. B. Honigbienen) üben. Übung hilft, Verletzungen oder Todesfälle für das Insekt zu minimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass es je nach fokalem Taxon Einschränkungen bei dieser Methodik geben kann. Die reduzierte Größe bestimmter Taxa kann die Verwendung teurerer und spezialisierterer Makrofotografiegeräte und/oder den Einsatz von Feldmikroskopen erfordern, da ihre Merkmale möglicherweise nicht isoliert und mit den in diesem Verfahren aufgeführten Materialien fotografiert werden können. Je kleiner das Ziel, desto schwieriger kann es sein, adäquate Bilder zu erhalten³⁷. Darüber hinaus können in Fällen, in denen unzugängliche Körperteile erforderlich sind (z. B. Zunge, Genitalien usw.), andere Methoden zur Identifizierung gerechtfertigt sein. Die Genitalien gehören zu den aussagekräftigsten diagnostischen Merkmalen für Insekten, die zwischen den Arten sehr unterschiedlich und in ihnen einigermaßen stabil sein können^38,39. In diesem Fall können tödliche Methoden, wie z.B. das Sezieren, notwendig sein. Bei schwer zu identifizierenden Arten kann jedoch die Verwendung kleiner, nicht-letaler genetischer Proben zur Identifizierung nach der Feldentnahme^{verwendet werden 40}, und die hier beschriebene Methodik kann zur Entnahme solcher Proben verwendet werden. Es wird auch eine statistische Modellierung entwickelt, um Bildgebung und DNA-Sequenzierung für die Identifizierung von Insekten zu verknüpfen⁴¹.

Eine weitere Einschränkung der hier vorgestellten Methodik betrifft die Wahrscheinlichkeit, bei der Durchführung dieses Protokolls gestochen zu werden, insbesondere wenn ein Loch in den Beutel geschnitten wird. Dieses Protokoll minimiert jedoch die Wahrscheinlichkeit, gestochen zu werden; Die Autoren wurden nur selten beim Hantieren mit Proben durch Probenbeutel gestochen. Es sollte auch beachtet werden, dass einige Bienenarten, Käfer und Wespen in der Lage waren, die Säcke mit ihren Mandibeln zu schneiden, so dass bei der Bestimmung, ob dieser Ansatz für die interessierenden Taxa funktioniert, Vorsicht geboten ist und in diesen Fällen dickere Plastiktüten oder andere Methoden empfohlen werden. In jedem Fall sollten die Benutzer die Verwendung von Einwegkunststoffen minimieren und nach Möglichkeit recyceln.

Das zentrale Taxon für die Entwicklung dieses Protokolls war die Blaue Calamintha-Biene, Osmia calaminthae (Hymenoptera: Megachilidae), die in Größe³² etwa 10-11 mm misst. Seit der Entwicklung dieser Methode haben die Autoren sie auf eine Vielzahl anderer Hymenopteren unterschiedlicher Größe angewendet, darunter größere Bombus-Arten (Hymnenoptera: Apidae) und Caupolicana-Arten , C. electa und C. floridana (Hymenoptera: Colletidae). Caupolicana electa kann zwischen 18 und 23 mm variieren, während C. floridana zwischen 16 und 18 mm variieren kann³³. Um negative Auswirkungen auf gefährdete, gefährdete oder gelistete Arten zu minimieren, wird empfohlen, es zuerst an eng verwandten und/oder häufigen Leihmüttern auszuprobieren, um Erfahrungen zu sammeln und Kenntnisse aufzubauen. Das Exoskelett von Bienen und anderen Insekten kann variieren, und weniger robuste Exemplare sollten mit Vorsicht behandelt werden. In Situationen, in denen kleinere oder weichere Insektenkörper untersucht werden, ist diese Methode möglicherweise nicht ausreichend. Die Benutzer müssen bestimmen, welche Teile dieser Methodik für ihr Fokustaxon geeignet sind.

Über das primäre Ziel hinaus, im Feld gesammelte Organismen für die Identifizierung einzuschließen, kann dieses Protokoll modifiziert werden, um verschiedene forschungsbezogene Aufgaben zu erfüllen, für die Bienen sicher eingesperrt werden müssen. So können beispielsweise Organismen im Feld gewogen werden, während sie sich in den wiederverschließbaren Probenbeuteln befinden. Forscher können auch verschiedene Messungen von Proben mit Messschiebern durchführen, während das Insekt gefangen ist. Zum Beispiel kann die Schätzung der Heimsuchfähigkeit von Bienen anhand der Körpergröße⁴² erfolgen; Unsere Methodik könnte dazu beitragen, Daten zu gewinnen, die eine solche Schätzung erleichtern würden. Anstatt Messschieber zu verwenden, können Forscher ein Lineal/eine Maßstabsleiste und/oder eine Farbkarte direkt hinter der Probe platzieren und fotografieren, um wichtige morphologische Merkmale bei der späteren Bildbearbeitung zu messen. Zukünftige Anwendungen dieser Methode könnten die Fortschritte in der künstlichen Intelligenz und im maschinellen Lernen nutzen. Die Identifizierung, sowohl im Feld als auch im Labor, könnte durch den Einsatz intelligenter Geräte optimiert werden, wodurch die Bearbeitungszeit und der Stress für die Proben minimiert werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos