Verhaltenstrainingsverfahren für kopffixierte Virtual Reality bei Mäusen

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren für das häufig verwendete Virtual-Reality-Paradigma (VR) mit linearer Spur bei Mäusen sowie die Bestimmung der Machbarkeit der Ausführung komplexer VR-Aufgaben durch Testen einer Y-förmigen Signalunterscheidungsaufgabe.

Zusammenfassung

Virtual Reality (VR) in Kombination mit Kopffixierung wird zunehmend in verhaltensneurowissenschaftlichen Studien eingesetzt, da sie die Durchführung komplexer Verhaltensassays an kopffixierten Mäusen ermöglicht. Dies ermöglicht präzise Verhaltensaufzeichnungen unter Einbeziehung verschiedener neurophysiologischer Techniken, die eine Kopffixierung erfordern, um bewegungsbedingtes Signalrauschen während neuronaler Aufzeichnungen zu minimieren. Trotz der zunehmenden Nutzung von VR gibt es jedoch nur wenige veröffentlichte Daten über die detaillierte Methodik der Implementierung. In dieser Studie wird ein Trainingsprotokoll entwickelt, bei dem männliche und weibliche C57B16/J-Mäuse darauf trainiert werden, einen virtuellen linearen Korridor zu durchlaufen, dessen Länge über mehrere Trainingseinheiten von 1-3 m erhöht wird. Aufbauend auf dieser Grundlage untersuchte diese Studie die Machbarkeit von Mäusen, komplexe Verhaltensweisen innerhalb von VR unter Verwendung eines Y-Labyrinth-Paradigmas auszuführen. Die Aufgabe erforderte, vom Auswahlpunkt im Y-Labyrinth aus zu dem Arm mit den schwarzen Wänden zu navigieren. Nach Erreichen eines Kriteriums von zwei aufeinanderfolgenden Tagen von mindestens 70 % Richtigkeit entwickelten sich die Mäuse zu einer zunehmend schwierigen sensorischen Unterscheidung. Die Ergebnisse liefern wichtige Details zu den Methoden, die für das erfolgreiche Training von Mäusen in VR nützlich sind, und zeigen, dass Mäuse Lernfähigkeiten beim Navigieren im Y-Labyrinth aufweisen. Die vorgestellte Methodik bietet nicht nur Einblicke in die Trainingsdauer in VR-basierten Assays, sondern unterstreicht auch das Potenzial für die Untersuchung komplizierter Verhaltensweisen bei Mäusen und eröffnet Wege für umfassendere neurowissenschaftliche Untersuchungen.

Einleitung

Virtual-Reality-Aufgaben haben sich aufgrund der Kopffixierung als leistungsfähige Methode zur Verhaltensbewertung bei Mäusen herausgestellt, die eine mechanische Stabilität ermöglicht, die bei sich frei verhaltenden Mäusen beeinträchtigt würde¹. Diese Methode ermöglicht reduzierte Bewegungsartefakte in elektrophysiologischen Aufzeichnungen ^2,3 und optischer Bildgebung ^4,5,6,7. Es ermöglicht auch wiederholbare Verhaltensweisen⁸ und präzises Eye-Tracking⁹. Im Versuchsaufbau wird die Maus fixiert und auf einem luftgestützten kugelförmigen Laufband platziert. Diese Apparatur ermöglicht die komplexe Erforschung von visuell geführtem Verhalten in der VR-Umgebung. Wenn sich die Maus auf dem Laufband bewegt, synchronisiert sich ihre Fortbewegung nahtlos mit ihrer Navigation in der virtuellen Landschaft, die auf dem die Maus umgebenden Bildschirm visuell dargestellt wird.

Das Ziel dieser Studie ist zweierlei: zentrale Herausforderungen innerhalb der experimentellen Verhaltensneurowissenschaften anzugehen und zur Weiterentwicklung der Methoden in diesem Bereich beizutragen. Erstens gibt es trotz des zunehmenden Einsatzes von VR in der akademischen Forschung 10,11,12 nach wie vor einen bemerkenswerten Mangel an umfassenden Methoden und Schulungsprotokollen, was die Einführung dieser Technologie durch neue Forscher behindert. Das primäre Ziel war es, diese Lücke zu schließen, indem ein detailliertes Trainingsschema für das lineare Gleis-Paradigma skizziert wurde, wie es in früheren Studien 13,14,15 dargestellt wurde. Zur Beschreibung dieser Betriebsabläufe wird ein kommerziell verfügbares System verwendet. Als Haftungsausschluss weisen diese Verfahrensrichtlinien Komponenten auf, die für dieses System spezifisch sind. Für eine Diskussion über die Verallgemeinerbarkeit dieses Protokolls siehe jedoch die Diskussion. Ziel war es, die Verhaltensverfahren, den typischen Zeitplan für die Durchführung dieser Verfahren und die Erfolgsrate beim Training von Mäusen für das Laufen auf einer einfachen linearen Bahn zu skizzieren.

Zweitens gibt es nach wie vor einen Mangel an Dokumentation über die Implementierung komplexer Labyrinthaufgaben innerhalb dieses Paradigmas bei Mäusen. Komplexe virtuelle Assays wurden an Ratten¹¹ entwickelt. Mäuse haben jedoch im Vergleich eine verminderte Sehschärfe¹⁶ und schneiden bei komplexen Aufgaben oft schlechter ab¹⁷. Während sich einige Untersuchungen auf spezifische Aufgaben wie Evidenzakkumulation oder räumliche Neuheit¹⁸ konzentriert haben, lag der Schwerpunkt hier auf der Aufklärung der Trainingsmethoden, die für Mäuse erforderlich sind, um sich an Entscheidungsparadigmen in VR-Umgebungen zu beteiligen. Um diese Herausforderung anzugehen, wurde eine Signalunterscheidungsaufgabe entwickelt, bei der die Mäuse ausschließlich lernen mussten, die Farbe/Leuchtdichte (schwarz versus weiß) des belohnten Arms mit der Belohnung zu assoziieren, was durch die Auswahl des schwarzen Arms am Auswahlpunkt des Y-Labyrinths erreicht wurde, wobei der richtige Arm in jedem Versuch randomisiert wurde. Diese Aufgabe war so konzipiert, dass sie eine Interaktion mit den virtuellen Hinweisen erforderte und einen Einblick in die Wahrnehmungsunterscheidungsfähigkeiten der Mäuse gab.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie kritische Lücken im Bereich der experimentellen Verhaltensneurowissenschaften schließt, indem sie umfassende Trainingsprotokolle für die Verwendung von VR-Paradigmen bei Mäusen bereitstellt und Methoden für komplexe Entscheidungsaufgaben in diesem Rahmen aufklärt. Durch die Nutzung von Erkenntnissen aus früheren Forschungen und innovativen experimentellen Designs zielt diese Studie darauf ab, die Forschungspraktiken zu rationalisieren und das Verständnis der neuronalen Mechanismen, die dem Verhalten zugrunde liegen, zu verbessern. In den folgenden Abschnitten werden die experimentellen Verfahren und Ergebnisse vertieft und die Ergebnisse diskutiert.

Protokoll

Alle Eingriffe mit Tieren wurden unter strikter Einhaltung der vom NIEHS Animal Care and Use Committee festgelegten Protokolle durchgeführt, um die Einhaltung ethischer Standards und Tierschutzrichtlinien zu gewährleisten. Für die Studie wurden C57BL/6Tac-Mäuse verwendet, die etwa 8 Wochen alt waren.

1. Chirurgie bei der Implantation einer Kopfstange

1. Vorbereitung der Operation
   1. Besorgen Sie sich die gewünschte Anzahl von Mäusen für Ihre Kohorte, idealerweise indem Sie sie einzeln unterbringen, um Interferenzen mit dem Kopfstangenimplantat zu minimieren, obwohl dies optional ist¹⁹. In dieser Studie wurde eine Stichprobengröße von drei männlichen und drei weiblichen Mäusen verwendet (anfänglich ausgeglichen, aber ein Männchen wurde zu Beginn des Trainings ausgeschlossen, nachdem es nicht auf dem Ball laufen konnte)
   2. Erwerben Sie die in der Materialtabelle angegebenen Materialien, und passen Sie sie entsprechend den Besonderheiten des Studiendesigns an.
   3. Bestimmen Sie bei der Erfassung der Mäuse individuelle Identifikatoren und bringen Sie entweder Schwanztätowierungen oder Ohrlochstanzen an, um eine eindeutige Identifizierung zu gewährleisten. Erstellen Sie ein umfassendes Protokoll, um ihre Gewichte systematisch aufzuzeichnen, wie es für das Wasserbeschränkungsverfahren erforderlich ist.
2. Verabreichung von Anästhesien
   1. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente griffbereit sind, einschließlich geeigneter Spritzen, eines Heizkissens, Metallwaren (wie Pinzetten, Mikroscheren und Hämostaten), Jodlösung, Augenschmiermittel und Becher für Kochsalzlösung und Wasserstoffperoxid. Um sterile Bedingungen zu gewährleisten, desinfizieren Sie alle chirurgischen Geräte und sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven.
   2. Bevor Sie mit der Operation fortfahren, führen Sie genaue Gewichtsmessungen der Mäuse durch und aktivieren Sie das Heizkissen auf 34 °C. Erfassen Sie alle notwendigen Informationen im Labor-/OP-Notizbuch Ihrer Einrichtung. Überprüfen Sie die Angemessenheit der Füllstände von Sauerstoff- und Isoflurantanks und bestätigen Sie die Verfügbarkeit aller wichtigen Materialien, um ununterbrochene chirurgische Eingriffe zu ermöglichen.
   3. Schärfen Sie die Maus und legen Sie sie in einen Nasenkonus, der an einem Verdampfer befestigt ist, der für kleine Tiere ausgelegt ist, die 4 % Isofluran und eine Sauerstoffflussrate von 3 l/min erhalten, um eine Anästhesie einzuleiten. Verwenden Sie einen Scavenger, um potenziell schädliche Abgase aufzufangen (empfohlen).
   4. Verabreichen Sie Petroleum ophthalmic veterinary salbe auf die Augen der Maus, während sie sich unter dem Nasenkegel befindet, um Augentrockenheit zu verhindern. Tragen Sie zunächst einen Tropfen auf jedes Auge auf und tragen Sie ihn bei Bedarf erneut auf. Sorgen Sie für einen konstanten Schutz der Augen, indem Sie immer eine Schicht dieses Schmiermittels mit regelmäßiger Kontrolle pflegen.
   5. Bereiten Sie die Operationsstelle (Abbildung 1A) am Kopf der Maus vor, indem Sie den Bereich rasieren, an dem der Schädel an der Kopfstange befestigt wird.
   6. Positionieren Sie die Schneidezähne der Maus in der stereotaktischen Vorrichtung unter dem Nasenkonus, stellen Sie die Sauerstoffflussrate auf 1 l/min ein und verabreichen Sie 1%-2% Isofluran aus dem Verdampfer. Stellen Sie einen ordnungsgemäßen Anästhesiefluss sicher, indem Sie die Ventile einstellen und entsprechend zwischen dem Induktionsnasenkonus und dem stereotaktischen Gerät wechseln. Strecken Sie das Hinterbein der Maus aus und üben Sie festen Druck auf die Zehen aus. Wenn der Fuß keine reflexartige Entzugsreaktion zeigt, deutet dies darauf hin, dass die Narkose wirksam ist. Wiederholen Sie dies alle 15 Minuten, zusammen mit einem Atemcheck.
   7. Sichern Sie den Kopf der Maus an Ort und Stelle, indem Sie chirurgische Stabilitätsstangen in den Gehörgängen anbringen, um mögliche Kopfbewegungen während der Operation zu minimieren.
   8. Bevor Sie Schnitte oder Injektionen vornehmen, sterilisieren Sie den rasierten Operationsbereich auf der Oberseite des Kopfes, indem Sie ihn mit einem in ein Jod-Antiseptikum getauchten Tupfer schrubben. Verwenden Sie ab diesem Zeitpunkt sterile Handschuhe, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
3. Verabreichung der Injektion
   1. Injizieren Sie subkutan 0,05 ml Bupivacain (lokale Analgesie) mit einer 25G-Nadel in die chirurgische Inzisionsstelle auf der Kopfhaut.
   2. Injizieren Sie subkutan 1 ml Kochsalzlösung (Hydratation) mit einer 25G-Nadel in eine Seite des interscapularen Bereichs.
   3. Injizieren Sie subkutan 0,05 ml Buprenorphin (Ganzkörperanalgesie) mit einer 25G-Nadel in die gegenüberliegende Seite der Interscapularregion.
4. Freilegung des Schädels
   1. Verwenden Sie eine Mikroschere, um einen Hautschnitt über den interfrontalen und internen Nähten des Schädels zu erstellen, beginnend knapp über dem Augenbrauenkamm und bis hinter die Hinterhauptkerbe (Abbildung 1A).
   2. Verwenden Sie Hämostatika, um den linken und rechten Lappen der Haut nach unten zu halten und den Schädel freizulegen.
   3. Verwenden Sie ein trockenes Wattestäbchen, um das Bindegewebe von der Kopfhaut zwischen den zurückgesteckten Hautfalten zu entfernen.
   4. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, das mit Wasserstoffperoxid benetzt (aber nicht gesättigt) ist, um die Kopfhaut zu schrubben, um die Sichtbarkeit der Nähte zu gewährleisten und darauf zu achten, dass kein Wasserstoffperoxid auf das umgebende Gewebe gelangt.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3 und 1.4.4 2x-3x, bis sowohl Bregma als auch Lambda deutlich sichtbar sind und die Kopfhaut gründlich gereinigt ist.
5. Chirurgische Schraubenimplantation
   1. Befestigen Sie zwei Schrauben am Schädel, wobei Sie eine Schraube posterior zum Bregma und die andere anterior zum Lambda positionieren (Abbildung 1B), um die Oberfläche für den Zahnkleber zu maximieren und die Stabilität des Kopfbügels zu erhöhen. Positionieren Sie die Position der Schrauben an Zielen in einem bestimmten Abstand von Bregma. Stellen Sie sicher, dass eine Schraube links und die andere rechts positioniert ist (d. h. anterior-posterior (AP) +1,00, medial-lateral (ML) -1,00 und AP -3,00, ML +3,00), und stellen Sie sicher, dass zwischen den Schrauben ausreichend Platz ist, um die Platzierung der Kopfstange zu ermöglichen und die Koordinaten und Anforderungen einzustellen.
   2. Bohren Sie Zielpositionen, um sicherzustellen, dass das Bohren auf den Knochen des Schädels beschränkt ist und nicht in das Hirngewebe eindringt.
   3. Schrauben Sie mit einem Schraubendreher etwa die Hälfte der Schraube fest. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Schraube.
6. Anbringen des Kopfbügelimplantats
   1. Mischen Sie den Zahnzement und geben Sie ihn auf die Unterseite des Kopfbügels, wobei Sie sich auf die konkave Oberfläche konzentrieren, und tragen Sie ihn entlang der interfrontalen Naht des Schädels auf.
   2. Positionieren Sie die Kopfstange über der interfrontalen Naht, um die Verbindung zwischen dem Zahnzement auf der Kopfstange und dem auf der Naht zu erleichtern. Halten Sie es mit der Hand im gewünschten Winkel ca. 5 Minuten lang fest an Ort und Stelle, bis es fest wird. Tragen Sie bei Bedarf zusätzlichen Zahnzement auf. (Abbildung 1C-E)
7. Wiederanbringen der Haut über der Kopfstange
   1. Lösen Sie die Hämostaten und verwenden Sie eine Pinzette, um die beiden Hautlappen über dem getrockneten, mit Zahnzement befestigten Kopfbügel wieder zu vereinen. Verwenden Sie topischen Gewebekleber, um die Haut sanft zusammenzuhalten, indem Sie den linken und rechten Teil der Kopfhaut langsam über dem Kopfbügel zusammenkleben, beginnend an der vorderen Inzisionsstelle und endend an der hinteren Inzisionsstelle.
   2. Lassen Sie den topischen Gewebekleber aushärten, um zu bestätigen, dass der Operationsbereich wieder versiegelt wurde, bevor Sie die Maus von den chirurgischen Stabilitätsstangen und dem Nasenkonus lösen.
   3. Setzen Sie die Maus in einen Käfig mit einfachem Gehäuse und stellen Sie sie auf ein Heizkissen bei 37,5 °C.
   4. Überwachen Sie die Maus sorgfältig auf Anzeichen von Unwohlsein oder Atemstörungen, bis sie wieder zu Bewusstsein gekommen ist. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder auf dem Brustbein liegt, Wachsamkeit zeigt und gehfähig ist.
   5. Lassen Sie die Mäuse nach chirurgischen Eingriffen eine 1-wöchige Ruhephase einlegen. Überwachen Sie die Mäuse täglich, um auffällige Gewichtsschwankungen zu erkennen und zu beheben. Stellen Sie den Mäusen 3 Tage nach der Operation Brei zur Verfügung, um die Genesung zu unterstützen. Um Interferenzen mit der Kopfleiste zu vermeiden, sollten Sie diese Mäuse einzeln unterbringen.

2. Flüssigkeits-Restriktion

HINWEIS: Wassermangel führt bei Mäusen zu einem Durstzustand, der ihre Motivation für flüssige Belohnungen erhöht. Eine sorgfältige Umsetzung ist jedoch notwendig, um den Erhalt des Wohlbefindens der Maus zu gewährleisten²⁰.

1. Legen Sie 1 Woche nach dem Operationstag die Ausgangsgewichte für Mäuse fest.
2. Kleben Sie ein Segment einer kleinen Petrischale (60 mm x 15 mm) mit der konkaven Seite nach unten auf den Käfigboden und kleben Sie eine kleinere Petrischale (35 mm x 10 mm) konkav bis zur Mitte der flachen Oberfläche der Petrischale, die mit Klebeband am Boden befestigt ist, mit einer weiteren kleinen Petrischale (60 mm x 15 mm), die konkav nach oben auf die flache Oberfläche der mittleren Schale geklebt ist, um als Wasserreservoir zu dienen (Abbildung 2).
3. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der oberen Schale eine Kontamination durch das Einstreumaterial verhindert und Mäusen gleichzeitig einen einfachen Zugang zu Wasser ermöglicht. Geben Sie das tägliche Wasservolumen mit einer Pipette in das Reservoir.
4. Geben Sie Mäusen an Tag 1 eine Dosis von 15 ml Wasser pro 100 g Körpermasse.
5. Geben Sie Mäusen an Tag 2 eine Dosis von 10 ml Wasser pro 100 g Körpermasse.
6. Geben Sie Mäusen an Tag 3 eine Dosis von 5 ml Wasser pro 100 g Körpermasse. Mäuse sollten während der gesamten Studie unabhängig vom Körpergewicht eine Mindestaufnahme von 1 ml Wasser pro Tag erhalten.
   HINWEIS: Forscher können sich dafür entscheiden, das Mindestvolumen gleichmäßig über alle Probanden hinweg zu verabreichen, obwohl solche Anpassungen mit sorgfältiger Abwägung vorgenommen werden sollten.
7. Halten Sie während der gesamten Studiendauer der Wasserzuteilung eine konstante Dosierung von 5 ml pro 100 g Körpergewicht (oder eine einheitliche Wasserzuteilung von 1 ml, falls bevorzugt)
   HINWEIS: Mäuse sollten an 1-2 Tagen pro Woche ad libitum Zugang zu Wasser erhalten, wenn die Mäuse kein VR-Experiment durchführen (z. B. am Wochenende). Dies erleichtert die Wiederherstellung ihres natürlichen Feuchtigkeitsgehalts. In Fällen, in denen Mäuse unter 90 % ihres aufgezeichneten Ausgangsgewichts fallen, sollten sie bis zum Erreichen von 90 % ihres Ausgangsgewichts auf ad libitum Wasserzugang umgestellt werden. Mäuse, die unter 80 % ihres aufgezeichneten Ausgangsgewichts fallen, sollten ethisch vertretbar eingeschläfert werden.
8. Verschieben Sie die Verabreichung ihrer täglichen Wasserdosis mindestens 30 Minuten nach der Verhaltensbewertung, um mögliche Beeinträchtigungen ihres natürlichen Durstverhaltens zu mildern, das für eine genaue Durchführung des Experiments unerlässlich ist.
   HINWEIS: Die Bereitstellung von liquiden Belohnungen unmittelbar nach einem Versuch kann die Leistung der Mäuse unbeabsichtigt beeinflussen, da sie möglicherweise eine sofortige Belohnung erwarten, was möglicherweise die Aufgabenbeteiligung beeinträchtigt. Daher verhindert die Verzögerung des Zugangs zu Wasser nach dem Versuch die Gewöhnung an die unmittelbare Belohnung und bewahrt die Integrität des Versuchsaufbaus.

3. Systemeinrichtung

1. Vertrautheit mit der Ausrüstung: Für die Hardwarekomponenten und andere Überlegungen der VR-Verhaltenssysteme siehe die folgenden Schritte.
   Im Diskussionsbereich finden Sie eine Untersuchung der Generalisierbarkeit des Protokolls auf vergleichbare Systemkonfigurationen.
   1. Vollständig immersives virtuelles Display oder Kuppel: Dieses virtuelle Display ermöglicht ein vollständiges Eintauchen eines Tieres in eine anpassbare virtuelle Umgebung. Die Bewegung innerhalb der virtuellen Umgebung wird mit der Bewegung auf dem kugelförmigen Laufband synchronisiert.
   2. Flüssiges Belohnungssystem: Das flüssige Belohnungssystem funktioniert durch die Abgabe von flüssiger Verstärkung (Wasser oder Zuckerwasser) über eine peristaltische Pumpe, die die Belohnungslösung durch ein kunststoffbeschichtetes Metallrohr leitet, das sich bei erfolgreicher Ausführung einer Aufgabe zur Maus erstreckt. Es enthält Sensoren, die die Menge der Belohnungen überwachen, die eine Maus während einer Testphase erhält.
      1. Reinigen Sie die Belohnungstube wöchentlich mit Ethylalkohol oder einem anderen Reinigungsmittel. Spülen Sie dazu 2-5 mL des Reinigungsmittels durch die Tube, ähnlich wie bei der Abgabe von Flüssigbelohnung, gefolgt von einer vergleichbaren Spülung mit gleicher Wassermenge.
      2. Bestimmen Sie zu Beginn des Experiments die Abgaberate der flüssigen Belohnung aus dem Belohnungsrohr, indem Sie es für eine bestimmte Dauer aktivieren und das Volumen der abgegebenen Flüssigkeit messen. Mit diesem Verfahren kann die Flüssigkeitsfördermenge der Schlauchpumpe bestimmt werden. In dieser Untersuchung wurde eine Dispensierrate von ca. 0,0083 mL/s verwendet.
         HINWEIS: Die meisten Systeme bieten programmierbare Einstellungen für die Dauer zwischen der Ausführung des Verhaltens und der Freigabe der Belohnung, die eine präzise Planung des Studienprotokolls auf der Grundlage des beabsichtigten Belohnungsvolumens pro Versuch ermöglichen. Die verwendete Menge wurde als ausreichend eingestuft, da sie der Maus ausreichend Zeit gab, die Belohnung zu konsumieren, und ihr Volumen schien motivierend zu sein.
      3. Einige Protokolle erfordern möglicherweise, dass die Maus den Belohnungsauslauf ableckt, um die Belohnungslieferung zu initiieren. Für die Art von Aufgaben, die hier verwendet wurden, lieferte diese Funktionalität Belohnungen, die ausschließlich von der erfolgreichen Ausführung des gewünschten Verhaltens abhängig waren (d.h. der Wahl des richtigen Arms im Y-Labyrinth). Dies hilft, Misserfolge zu Beginn des Trainings zu vermeiden, bei denen die Tendenz zum Lecken nicht ausreichend festgestellt wurde und das anfängliche Lecken weniger wahrscheinlich ist. Es kann auch die Messung der Belohnungserwartung ermöglichen, die unter bestimmten Bedingungen von der Navigationsleistung getrennt werden kann¹¹.
      4. Während einige Experimente mit Flüssigkeitsrestriktion sich für die Verwendung von Standardwasser durch die Belohnungsröhre entscheiden, wird hier Zuckerwasser (10% Saccharose v/v) als zusätzlicher Motivationsreiz innerhalb des operanten Paradigmas verwendet. Insbesondere wurde eine verbesserte Leistung in mehreren experimentellen Kohorten durch die Einführung von Zuckerwasser beobachtet.
   3. Styroporball: Dieser Ball fungiert als kugelförmiges Laufband. Wenn sie von unten mit Luft gepolstert sind, trainieren Sie die Mäuse, bequem auf dem Ball zu laufen oder zu gehen. Positionieren Sie ihn auf einem Ballhalter, der mit Bewegungsverfolgungssensoren ausgestattet ist, die Daten über Entfernung und Geschwindigkeit sammeln.
   4. Kopfhalter: Positionieren Sie das Gerät hinter der Maus und stellen Sie sicher, dass es nach dem Anbringen der Kopfstange an der Halterung visuell mit dem VR-Display ausgerichtet ist. Diese Vorrichtung ist entscheidend, um die Maus in einer kopffesten Position zu halten und dadurch Bewegungsartefakte zu mildern, insbesondere wenn das System neben optischen Bildgebungs- oder elektrophysiologischen Techniken eingesetzt wird.
   5. Luftstrom-Hardware: Konfigurieren Sie den Luftstrom von einer Druckluftquelle zum Ball, um eine schwerelose Umgebung zu schaffen, die für Mäuse geeignet ist, auf dem Ball zu laufen. Für diesen Aufbau ist ein Durchflussregler erforderlich, um eine präzise Kontrolle über den auf die Kugel ausgeübten Luftdruck zu gewährleisten. Der Ball arbeitet effizient in der schwerelosen Umgebung mit minimaler Luftzufuhr. Achten Sie daher bei der Einrichtung des Systems auf die Mindestmenge an Luft, die erforderlich ist, um eine reibungslose und ungehinderte Bewegung des Balls innerhalb des Halters zu ermöglichen. Ein Durchfluss zwischen 10-20 L/min wird empfohlen.
2. Software-Setup: Spezifische Details zum Betrieb des Systems finden Sie weiter unten.
   HINWEIS: Ähnlich wie das Design von Videospielen²¹ integriert die Architektur virtueller Welten Schlüsselelemente wie einen externen Controller, eine programmierbare navigierbare Umgebung und eine Zeitplandatei, die ein Zustandsdiagramm enthält, das dynamische Funktionen beschreibt. Diese Komponenten arbeiten synergetisch zusammen, um ein zusammenhängendes interaktives Erlebnis für Probanden zu schaffen, die an Forschungsstudien beteiligt sind. Die betriebliche Effizienz der Software hängt von der präzisen Organisation der Dateien in den dafür vorgesehenen Ordnern ab. In dieser Erklärung werden die wichtigsten Schritte beschrieben, die zum Ausfüllen vorgefertigter Vorlagen erforderlich sind, sodass vorhandene Dateien einfach angepasst und als neue Versionen gespeichert werden können. Diese neuen Versionen werden dann die Grundlage der Studie bilden.
   1. Verwenden Sie die folgenden drei Dateien zusammen, um eine betriebsbereite virtuelle Landschaft zu konfigurieren.
      1. XML-Dateien: Dieses Dateiformat bietet Benutzern die Möglichkeit, die Fototextur verschiedener Elemente wie Himmel, Boden und Wände zu bearbeiten. Platzieren Sie die für die Bilddaten verwendeten Dateien im Unterordner "Data" des Ordners "VR". Anhand dieser legen Sie die Abmessungen des Labyrinths fest und bestimmen die Anfangsposition der Maus innerhalb des Labyrinths. Definieren Sie mit diesen Dateien 3D-Objekte (visuelle Hinweise) an bestimmten Knoten innerhalb des Labyrinths. Ändern Sie diese Dateien mit einem Texteditor.
      2. XLSX-Dateien: Diese fungieren als Befehlsdateien, die alle drei Dateitypen (XML, XLSX und XAML) zusammen konfigurieren, um eine zusammenhängende und interaktive virtuelle Präsentation zu bilden. Verwenden Sie diese Dateien, um die experimentellen Routinen zu definieren, die die VR ausführen, und ihr Zubehör, z. B. die Verstärkungsempfindlichkeit, die extrahierten Daten und die Dateien, die für ein Experiment gruppiert werden.
      3. XAML-Dateien: Die Softwareanwendung bietet eine grafische Oberfläche für die Erstellung von Versuchsplänen durch die Verwendung von Flussdiagrammen. Es erleichtert die Definition von zeitlichen Parametern für den Versuch, Kontrollen für die Teleportation nach Abschluss des Versuchs und den Aktivierungszeitpunkt für digitale Ausgänge innerhalb des Versuchsrahmens.
   2. Verwenden Sie die folgenden Anwendungen für die Erfassung von Daten und die Benutzersteuerung des Systems während des Betriebs.
      1. [Anwendung] VR: Öffnen Sie die Datei, die mit der .XML Datei verknüpft ist, die die repräsentative Landschaft anzeigt, um eine Vorschau der virtuellen Landschaft auf den Monitoren im statischen Modus anzuzeigen. Öffnen Sie für eine dynamische Interaktion die gekoppelte Konfiguration. XLSX-Datei in der Steuerungsanwendung.
      2. [application]-Steuerelement: Öffnen Sie diese Anwendung, die mit der XSLX-Datei verknüpft ist, um die mit dem System verknüpften Zubehörgeräte anzuzeigen. Von hier aus kann man das Belohnungsrohr manuell aus- und einfahren, eine flüssige Belohnung ausgeben und die Datenerfassung in Echtzeit anzeigen.
      3. [application] Zeitplan-Designer: Diese Anwendung bietet die Möglichkeit, XAML-Dateien anzupassen, um einen Zeitplan für das Auslösen von Ereignissen innerhalb des Experiments festzulegen. Entwerfen Sie beispielsweise einen anpassbaren Auslöser, um die Dauer für die Ausgabe von Belohnungen zu bestimmen und die Dauer der Pausen zwischen den Versuchen für Mäuse zu definieren.
3. Beispiel für einen Start: Beginnen Sie mit der Entscheidung, wie das Studienprotokoll auf der Grundlage der einstellbaren Komponenten aus den Schritten 3.2.1.1 bis 3.2.1.3 aussehen wird. Nachdem ein operantes Protokoll klar definiert ist, öffnen Sie eines der Vorlagenexperimente, die mit dem VR-System voreingestellt wurden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Öffnen Sie die VR-Anwendung, die mit dem Unterordner Data geöffnet wird. Speichern Sie die erstellte virtuelle Landschaft als XML-Datei. Öffnen Sie diese Datei, und die virtuelle Landschaft sollte auf den VR-Monitoren erscheinen.
   2. Öffnen Sie die Anwendung Control und navigieren Sie zum Symbol Ordner öffnen oben rechts auf dem Bildschirm. Klicken Sie auf das Symbol, das den Ordner Configs aufrufen sollte, in dem die entsprechende . Die experimentelle XLSX-Konfiguration befindet sich. Öffnen Sie die . XLSX-Datei mit dem gleichen Namen wie die .XML Datei, die in der VR-Anwendung geöffnet wurde. Das definierte Systemzubehör, wie die Pumpe und der Motor für die ausfahrbare Belohnungsvorrichtung, sind nun unter dem Reiter Steuerung innerhalb der Anwendung sichtbar.
   3. Starten Sie den experimentellen Versuch, da die Koordination zwischen diesen beiden Anwendungen die Erstellung einer interaktiven virtuellen Landschaft ermöglicht. Letztendlich erleichtert diese Integration die Überwachung wichtiger Daten, einschließlich der Entfernung in der XY-Ebene und das Sammeln von Belohnungen mit Zeitstempeln.
4. Datenerfassung: Extrahieren Sie die wertvollsten Verhaltensdaten aus dem System, bei denen es sich um Positionsdaten und Belohnungen mit Zeitstempel handelt. Diese Daten werden gesondert als Logfiles gespeichert.
   1. Positionsdaten: Um diese zu erfassen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
      1. Um mit einem Zeitstempel versehene XY-Positionsdaten der Mäuse zu erfassen, öffnen Sie zunächst die Tabellenkalkulationsdatei des Labyrinths der gewünschten Datenerfassung. Fügen Sie in Tabelle 1 den Befehl WriteVRAndCamInfoToFile in eine der Zellen unter den anderen Zellen in Spalte A ein. Jetzt werden Positionsdaten nach einer Testphase automatisch als datierte CSV-Datei (mit dem Namen Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv) im Konfigurationsordner gespeichert.
      2. Um die Positionsdaten nach einem Versuch zu exportieren, schließen Sie die Steuerungsanwendung, und die Daten werden in einer datierten CSV-Datei gespeichert. Diese Datei enthält alle spezifischen Daten für einen bestimmten Tag, also achten Sie darauf, manuell zu notieren, wann jedes Motiv auf den Ball gelegt und vom Ball genommen wurde. Öffnen Sie die Datei und importieren Sie sie mit dem Unicode-Zeichensatz UTF-8. Spalte A ist mit DateTime beschriftet, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Registerkarte A und klicken Sie auf Zellen formatieren. Gehen Sie zur Zeit und klicken Sie auf die Option MM/DD/YYYY HH:MM: SS . Nun wird jedes Systemereignis für die weitere Datenanalyse chronologisch katalogisiert.
   2. Belohnungsdaten: Um diese zu erhalten, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
      1. Die Daten zur Pumpenaktivierung (Belohnungsabgabe) werden automatisch als datierte Protokolldateien im System gespeichert, so dass kein Befehl wie bei den Positionsdaten eingegeben werden muss. Um auf diese zuzugreifen, gehen Sie zum Unterordner Protokolldateien des Ordners configs.
      2. Wiederholen Sie Schritt 3.4.1 für Positionsdaten für die Belohnungsdaten, um die Daten als Tabellenkalkulationsdatei zu exportieren. Öffnen Sie den Ordner configs, und wählen Sie die datierte Belohnungsdatei (mit dem Namen Corridor- MM.DD.YYYY oder Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY) aus, wenn sie im Ordner angezeigt wird. Dies gibt das Datum und die Uhrzeit an, zu der die Mäuse die Belohnungen erhalten haben, und man kann dies je nach verwendetem Paradigma in der weiteren Datenanalyse verwenden.

4. Verhaltensaufgaben

HINWEIS: In Übereinstimmung mit etablierten Methoden der Verhaltensneurowissenschaften verwenden die formulierten Aufgaben eine belohnungsbasierte assoziative Lerntechnik. Durch den Einsatz sofortiger Belohnungen zur Verstärkung bestimmter Verhaltensweisen werden die Tiere effektiv darauf trainiert, sich wiederholende Aufgaben auszuführen, was durch die Teleportationsfähigkeit von VR erleichtert wird. Innerhalb eines virtuellen Verhaltensrahmens ermöglicht die Teleportationsfunktionalität Mäusen, sich ohne den Stress, der mit physischer Manipulation verbunden ist, an Aufgaben zu beteiligen, wodurch gleichzeitig die Einrichtungsdauer reduziert wird, die für analoge Aufgaben in der realen Welt erforderlich ist. Verwenden Sie während der Trainingseinheiten eine gedämpfte rote Deckenbeleuchtung innerhalb der Versuchsumgebung. Diese Vorsichtsmaßnahme wird aufgrund der verminderten visuellen Wahrnehmungsempfindlichkeit von Mäusen gegenüber rotem Licht empfohlen, die im Gegensatz zur Verwendung von weißem Licht eine mögliche Interferenz mit ihrer Wahrnehmung der Virtual-Reality-Bildschirme (VR) abschwächt²².

1. Gewöhnung
   1. Beginnen Sie die Gewöhnung an das kugelförmige Laufband gleichzeitig mit ihrer Gewöhnung an die Flüssigkeitsregulation, um die Leckröhre mit der Belohnung zu verbinden, indem Sie die richtig getimte physiologische Motivation verwenden. Eine dreitägige Gewöhnungsphase wird empfohlen, bevor Sie mit dem linearen Bahntraining beginnen.
   2. Fassen Sie die Mäuse am 1^. Tag nach dem Wiegen 5 Minuten lang an. Während dieser Interaktion wird empfohlen, das Kopfstangenimplantat vorsichtig zu greifen, während sich die Mäuse in ihrem Käfig befinden, um eine Vertrautheit mit einer solchen Manipulation zu schaffen. Führen Sie sie in den Bereich ein, in dem die VR an diesem Tag untergebracht ist, damit sie die räumliche Umgebung antizipieren können, in der experimentelle Versuche stattfinden werden. Dieser erste Tag der Gewöhnung fällt mit dem Beginn der Flüssigkeitsregulierung von 15 ml pro 100 mg Körpermasse zusammen.
   3. Am 2^. Tag, der mit dem Übergang zu den 10 ml pro 100 mg Körpermasse-Flüssigkeitsregulierung übereinstimmt, behandeln Sie die Mäuse erneut 5 Minuten lang. Fahre mit dem wiederholten sanften Greifen der Kopfstange fort, während du dich im Käfig befindest. Befestigen Sie die Kopfstange an der Halterung und lassen Sie die Mäuse sich 5-20 Minuten lang mit dem kugelförmigen Laufband vertraut machen, entweder auf einer sich unendlich wiederholenden Bahn oder ohne aktiviertes Softwareprogramm. Dies erleichtert die Anpassung an den kopffesten Zustand. Es sollte damit gerechnet werden, dass Mäuse während dieser Zeit Abfallstoffe ausscheiden können, die in der Regel im Laufe der aufeinanderfolgenden Sitzungen abnehmen.
   4. Am 3^. Tag, der dem letzten Tag des Flüssigkeitsregulationsparadigmas entspricht (5 ml pro 100 mg Körpermasse), behandeln Sie die Mäuse 5 Minuten lang. Befestigen Sie sie dann sicher an dem luftgepolsterten kugelförmigen Laufband und führen Sie sie durch den Belohnungsschlauch an flüssige Belohnungen heran.
      1. Wenn du naiven Mäusen den Leckauslauf vorführst, werden sie zunächst verwirrt, also stelle sicher, dass die Maus weiß, dass sie aus der Tube trinken soll.
   5. Wenden Sie die untenstehenden Richtlinien für die Positionierung der Maus an, ohne zu aufdringlich zu sein, und individualisieren Sie die Positionierung der Maus auf dem Ball in Bezug auf die Röhre so, dass die Belohnung auf komfortable Weise an sie geliefert wird. Achten Sie zu Beginn darauf, dass die Mäuse aus der Röhre trinken; Dies tritt bei den meisten Mäusen auf natürliche Weise unter wasserbeschränkten Bedingungen auf, wenn sie mit Flüssigkeit zu trinken konfrontiert werden.
2. Positionierung der Mäuse
   1. Vorpositionierung: Bevor Sie die Maus auf den Ball setzen, verlängern Sie das zentrierte Belohnungsrohr mit einem kleinen Belohnungströpfchen an der Spitze. Verlängern Sie das Belohnungsrohr, bevor Sie die Maus auf dem Ball positionieren, um mögliche Verletzungen zu vermeiden, die durch versehentliches Ausfahren des Rohrs nach vorne entstehen, sobald die Maus mit dem Kopf fixiert ist. Heben Sie den Belohnungsschlauch 5-15 mm über das kugelförmige Laufband an, so dass das Lecken des Auslaufs eine natürliche nach vorne gerichtete Haltung des Kopfes erfordert.
   2. Kopffixierung: Um die Maus zu fixieren, platzieren Sie die Maus auf der dominanten Seite des Handlers des kugelförmigen Laufbands. Ziehen Sie dann die Maus mit der dominanten Hand des Hundeführers an der Kopfstange in Richtung der Kopffixierungsplattform. Platzieren Sie die Kopfstange in dem Schlitz, der befestigt werden soll, und klicken Sie dann mit der nicht dominanten Hand des Hundeführers die Kopfstange ein.
   3. Position auf dem Ball: Passen Sie die Platzierung auf dem kugelförmigen Laufband für jede Maus individuell an, stellen Sie jedoch sicher, dass sie die folgenden Anforderungen erfüllen, um die Motivation für das Probieren der Belohnung zu gewährleisten und den allgemeinen Stress zu minimieren.
      1. Richten Sie die mittlere Sagittalebene der Maus mit der Mitte des kugelförmigen Laufbandes aus. In Fällen, in denen die Kopfleiste nicht gerade ist, stellen Sie sicher, dass die mittlere Sagittalebene der Maus und nicht die Kopfleiste mit der Mitte der Platzierung übereinstimmt. Zur visuellen Übersichtlichkeit siehe Abbildung 3C.
      2. Stellen Sie sicher, dass die Hinterpfoten der Maus nicht mehr als 11 cm von der Spitze des kugelförmigen Laufbandes entfernt sind und dass sich der Kopf hinter der Spitze befindet. Stellen Sie sicher, dass alle vier Pfoten das Laufband berühren und dass der Bauch das Laufband berühren kann, wenn die Maus ruht. Dies unterstützt den richtigen Gang und die Stabilität des Balls beim Laufen.
      3. Wenn Mäuse nicht laufen, spricht man von Ballverweigerung. Wenn die Mäuse weiterhin erstarren und nicht versuchen zu rennen, leiden sie wahrscheinlich unter übermäßiger Angst, und der Forscher entscheidet sich, sie vom Experiment auszuschließen. In dieser Studie wurde ein quantitativer Schwellenwert von 5 Tagen Ballverweigerung verwendet, um den Ausschluss aus den Daten zu bestimmen.
   4. Side Bias: Wenn Mäuse sich zum ersten Mal an die Trainingsroutine gewöhnen, bevorzugen sie eine Seite gegenüber der anderen. Dies kann die Aufgabenerfüllung beeinträchtigen, also achten Sie darauf, dass eine Seitenpräferenz nicht auf eine Asymmetrie in der Art und Weise zurückzuführen ist, wie das Tier auf dem Ball montiert ist. Die Y-Labyrinth-Aufgabe, die hier zum Einsatz kommt, erfordert, dass das Tier sowohl rechte als auch linke Entscheidungen trifft, um die Belohnung zu optimieren, was die Überwindung von Seitenpräferenzen erleichtert.
   5. Belohnungsauslauf: Bei diesem Ansatz handelt es sich um ein sanftes Manöver, das als Kiss-it-Methode bezeichnet wird, bei dem die Maus in Richtung des ausgefahrenen Leckschlauchs geführt wird, bis ihr Mund fast die Spitze des Auslaufs berührt, um eine genaue Abgabe der Belohnung zu gewährleisten. Stellen Sie die Dauer der verlängerten Belohnungsröhre auf 1 s ein, wenn Mäuse Belohnungen erhalten, damit die Maus ausreichend Zeit hat, das Tröpfchen vollständig zu verbrauchen. Individualisieren Sie die Positionierung des Leckauslaufs für jede Maus, da die Größe und die bevorzugte Positionierung für jede einzelne Maus unterschiedlich sein können. Stellen Sie sicher, dass die Belohnungsröhre während aller Versuche zentriert bleibt, um das Lecken zu standardisieren. Die Maus sollte immer damit rechnen, die Belohnung am selben physischen Ort zu erhalten, unabhängig vom Design des virtuellen Labyrinths.
      HINWEIS: Obwohl die Bestimmung dieser Dauer im Ermessen des Prüfarztes liegt, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass dieser Zeitrahmen die vollständige Belohnungsaufnahme durch die Maus vor dem Zurückziehen der Sonde wirksam erleichterte. Abbildung 3B zeigt ein Beispiel für eine bevorzugte Positionierung für die Platzierung.
   6. Lineare Bahn: In Übereinstimmung mit früheren Studien, die ähnliche Methoden verwendeten, verwenden Sie eine lineare Bahnaufgabe, um zwei Schlüsseluntersuchungen zu untersuchen: die Zeit, die benötigt wird, um Mäuse zu trainieren, einen geraden Korridor zu durchqueren, und die erwartete Erfolgsrate beim Erwerb von Belohnungen durch Mäuse.
      1. Stellen Sie sicher, dass sich die Mäuse sowohl an das Paradigma der Flüssigkeitsrestriktion als auch an die experimentelle Hardware gewöhnt haben.
      2. Führen Sie täglich eine 30-minütige Sitzung durch, um sich entlang eines linearen virtuellen Korridors zu bewegen, der mit einer Länge von 1 m beginnt. Wenn du das Ende des Korridors erreicht hast und die Belohnung für die Zuckertröpfchen erhalten hast, teleportierst du die Mäuse zurück zum Ausgangspunkt.
      3. Bestimmen Sie einen kriterienbasierten Fortschritt zu längeren Labyrinthen (z. B. 1 m, 2 m, 3 m). Bringen Sie die Mäuse auf die nächste Labyrinthlänge, nachdem Sie an 2 aufeinanderfolgenden Tagen durchschnittlich 2 Belohnungen pro Minute erhalten haben (Abbildung 4A).
      4. Dokumentieren Sie tägliche Aufzeichnungen von mit Zeitstempel versehenen Daten zum Abrufen von Belohnungen und der von Mäusen auf dem kugelförmigen Laufband zurückgelegten Strecke für die weitere Analyse (Abbildung 4B-D).
      5. Für Mäuse, die auf den 3 m langen linearen Strecken durchschnittlich 2 Belohnungen pro Minute erhalten, markieren Sie sie als kompetent auf dem linearen Schienen-Paradigma. Es wird empfohlen, dass Mäuse diese Phase erreichen, bevor sie zu komplexeren Verhaltensaufgaben übergehen, die eine Entscheidungsfindung erfordern.
   7. Komplexe Verhaltensaufgaben, die eine Entscheidungsfindung erfordern (Y-Maze): In dieser Phase wird untersucht, ob es möglich ist, von einer einfachen zu einer komplexeren Verhaltensaufgabe überzugehen, die eine Entscheidungsfindung erfordert. Um dies zu erreichen, erstellen Sie eine entwickelte Y-Maze-Aufgabe zur Signalunterscheidung.
      1. In diesem Y-Labyrinth-Paradigma ^23,24 stellen Sie sicher, dass die Mäuse zu einem Auswahlpunkt navigieren, an dem sich zwei Arme wie bei einem Y um 45° in beide Richtungen ausstrecken. Deaktivieren Sie die Drehung vom Startpunkt des Labyrinths bis zum Erreichen des Auswahlpunkts, zwei Arme unterschiedlicher Farbe, und aktivieren Sie sie dann innerhalb der Entscheidungszone, damit sich die Maus in die gewünschte Richtung drehen kann.
      2. Beim Eintritt in den Arm, der zur Belohnungszone führt, deaktiviere die Rotation erneut. Ein schwarzer Arm stellt den korrekten Pfad dar, während ein weißer Arm den falschen Pfad darstellt. Verwenden Sie den schwarzen und den weißen Arm als Anhaltspunkte, um mögliche Einschränkungen der Sehschärfe von Mäusen auszugleichen, da sie leicht zu unterscheiden sind und eine Untersuchung ihrer Nutzung visueller Informationen in ihrer einfachsten Form erleichtern.
      3. Trainieren Sie die Mäuse, zum schwarzen Arm zu navigieren, um eine Zuckerbelohnung zu erhalten, wobei jeder Versuch damit endet, dass die Mäuse zurück zum Startort teleportiert werden. Integrieren Sie in das Versuchsdesign ein zufälliges Mischen der Belohnungsorte zwischen der linken und rechten Seite, um sicherzustellen, dass Mäuse die Belohnung mit den visuellen Hinweisen und nicht mit der spezifischen Seite assoziieren.
      4. Verwenden Sie die gleichen Schritte zum Einrichten des Y-Labyrinths wie für den linearen Korridor. Spiegeln Sie die Kriterien für den Fortschritt im Y-Labyrinth-Paradigma mit denen des linearen Korridors wider: Jeder Versuch dauert 30 Minuten, und die Mäuse müssen an 2 aufeinanderfolgenden Tagen eine vorher festgelegte Belohnungsschwelle erreichen. Ein Schwellenwert von 70 % der korrekt erworbenen Belohnungen wird empfohlen, basierend auf der durchschnittlichen Leistung früherer Pilotenkohorten im Y-Labyrinth. sie liegt über der Zufallsschwelle (50%) und stellt einen vernünftigerweise erreichbaren Prozentsatz dar, der darauf hinweist, dass Mäuse die Aufgabe verstehen (Abbildung 5A).
      5. Wenn Sie den Auswahlpunkt erreicht haben, stellen Sie sicher, dass die Maus einen der richtigen oder falschen Arme auswählt. Teleportiere ihn am Ende des Arms zurück zum Ausgangspunkt, um das Labyrinth innerhalb von 30 Minuten zu wiederholen.
      6. Dieser Ansatz verwendete einen von der visuellen Psychophysik inspirierten Ansatz, bei dem es immer schwieriger wurde, die Labyrinthe zu unterscheiden. Befolgen Sie die untenstehende Beschreibung, um den Fortschritt im Y-Labyrinth-Paradigma zu erfahren.
         1. Präsentieren Sie im anfänglichen Y-Labyrinth solide schwarze und weiße Arme am Auswahlpunkt des Labyrinths. Wenn die Maus in 70 % der Versuche an 2 aufeinanderfolgenden Tagen den schwarzen Arm richtig gewählt hat, können Sie sie auf eine nachfolgende Stufe mit immer anspruchsvolleren Unterscheidungsaufgaben bringen. Um dies zu erreichen, führen Sie nach und nach zusätzliche 10 % der Kontrastfarbe auf jedem Arm auf jeder Fortschrittsstufe ein. Stellen Sie zum Beispiel den weißen Arm so um, dass er zu 90 % aus Weißen und zu 10 % aus Schwarzen besteht und umgekehrt, wodurch die Diskriminierung mit jedem Fortschritt anspruchsvoller wird.
            HINWEIS: Die Idee für eine Erhöhung ist, wenn 50 % Weiß/Schwarz erreicht werden können, wäre dies eine wirksame Kontrolle, da die Arme nicht zu unterscheiden wären. Die weiteste, die die Mäuse visuell unterscheiden konnten, lag jedoch bei 80 %:20 % (Abbildung 5B).

Ergebnisse

Diese Pilotstudie zielte darauf ab, Methoden für das effiziente Training von Mäusen in zwei unterschiedlichen Aufgaben zu skizzieren: einem einfachen Korridor und einer komplexen Entscheidungsaufgabe (der Y-Labyrinth-Aufgabe zur visuellen Unterscheidung). Diese Daten dienten als Grundlage für die Etablierung zeitlicher Richtlinien für das Verhaltenstraining in VR.

Die Verfahrensschritte beginnen mit der Skizzierung der chirurgischen Implantation der Kopfstange in Abbildung 1. Dieses Implantat dient dazu, den Schädel der Maus bei der Verhaltensbeurteilung zu stabilisieren und so die Präzision der neuronalen Aufzeichnungen zu erhöhen, insbesondere in Verbindung mit Elektrophysiologie oder bildgebenden Verfahren.

Abbildung 2 und Abbildung 3 veranschaulichen die Hardwarekomponenten und den Aufbau des experimentellen Systems. Abbildung 2 zeigt das Wasserversorgungssystem, das eine Petrischalen-Fontänenmethode verwendete. Dazu wurde eine 60 mm x 15 mm große Petrischale mit der konkaven Seite nach unten auf dem Käfigboden befestigt, eine kleinere 35 mm x 10 mm große Petrischale mit der konkaven Seite nach unten in der Mitte der größeren Schale befestigt und eine weitere 60 mm x 15 mm Petrischale mit der konkaven Seite nach oben auf die kleinere Schale gelegt, um als Wasserreservoir zu dienen. Die Höhe der oberen Schale wurde sorgfältig angepasst, um eine Kontamination durch Einstreumaterial zu verhindern und gleichzeitig sicherzustellen, dass Mäuse leichten Zugang zu Wasser hatten.

In Abbildung 3 sind die Richtlinien für die Positionierung der Systemhardware und der Maus dargestellt. Abbildung 3A zeigt das VR-Setup, das aus einem Array mit sechs Bildschirmen und einem kugelförmigen Laufband bestand, das in der Mitte positioniert war. Abbildung 3B zeigt die optimale Platzierung der Maus auf dem Laufband, wobei der Kopf in einer natürlichen Position ausgerichtet ist und alle vier Pfoten Kontakt zur Oberfläche haben. Abbildung 3C vergleicht die korrekte und falsche Platzierung der Maus relativ zur Kopfleiste und betont, dass die mittlere Sagittalebene der Maus zentriert und nicht mit der Kopfleiste selbst ausgerichtet sein sollte.

Abbildung 4 zeigt die Belohnungsakquisitionskurven in einem Liniendiagramm, das die erwarteten Lernzeiträume für 1 m, 2 m und 3 m schmale Korridore in VR auf der Grundlage vordefinierter Parameter für die Progression veranschaulicht. Es zeigt die durchschnittlichen Geschwindigkeiten von Mäusen über die jeweiligen Spurlängen und zeigt eine allmähliche Zunahme der Geschwindigkeit als Beweis für das Lernen und die Verbesserung der Aufgabe entsprechend der zunehmenden Schwierigkeit. Es wird auch ein Balkendiagramm gezeigt, das die durchschnittliche Anzahl der Tage veranschaulicht, die Mäuse benötigen, um das Kriterium für die linearen Spuren zu erreichen, sowie ein Balkendiagramm, das die mittleren Geschwindigkeiten für jede Spurlänge anzeigt. Im Anschluss daran werden auch die fortschreitenden Stufen der linearen Gleisaufgabe veranschaulicht, die von den Mäusen gelernt wurden. Diese Aufgaben wurden entwickelt, um in der akademischen Literatur etablierte Methoden zu replizieren und gleichzeitig eine für Mäuse machbare Lernkurve zu gewährleisten und ihren Aufstieg durch die Stufen zu erleichtern.

Abbildung 5 schließlich enthält Daten zur Y-Maze-Aufgabe. Die Abbildung verdeutlicht den progressiven Charakter der Aufgabe, beginnend mit einer einfachen Unterscheidung zwischen massiven schwarzen und weißen Armen. Diese Anfangsphase dient als grundlegender Schritt, um die Fähigkeit der Mäuse zu etablieren, zwischen kontrastierenden visuellen Reizen zu unterscheiden. Die nachfolgenden Stufen der Aufgabe führen zu einer zunehmenden Komplexität, indem zusätzliche Prozentsätze der Kontrastfarbe in jeden Arm eingebaut werden, wodurch die Unterscheidungsfähigkeit der Mäuse weiter herausgefordert wird. Die allmähliche Steigerung der Aufgabenschwierigkeit wird durch den Übergang von einfarbigen schwarz-weißen Armen zu Armen veranschaulicht, die zu 90 % aus einer Farbe und zu 10 % aus der anderen Farbe bestehen. Bemerkenswert ist, dass die in Abbildung 5 dargestellten Daten darauf hindeuten, dass sich die Unterscheidungsgenauigkeit zwar mit jedem Fortschreiten verbessert, einige Mäuse jedoch durchweg eine Schwelle der visuellen Unterscheidungsfähigkeit aufweisen, die ein Maximum von 80 %/20 % weiß/schwarzer Unterscheidung erreicht. Diese Beobachtung unterstreicht die Einschränkungen der visuellen Unterscheidungsfähigkeit der Mäuse im Rahmen der Y-Maze-Aufgabe und liefert wertvolle Einblicke in die Machbarkeit der Aufgabe und die kognitiven Fähigkeiten der Probanden. Anschließend werden die progressiven Stufen der Y-Labyrinth-Gleisaufgabe detailliert beschrieben, die so konzipiert wurden, dass sie sich an etablierten Methoden in der Literatur orientieren. Diese Stadien sorgten für eine praktikable Lernkurve für die Mäuse und unterstützten ihren allmählichen Aufstieg durch die Stufen.

Abbildung 1: Chirurgische Anweisungen für die Kopfstangenimplantation. (A) Die Inzisionsstelle ist am Schädel der Maus markiert. (B) Die Schrauben sollten 1 mm links von der interfrontalen Naht etwas unterhalb des Bregmas und 3 mm rechts von der interfrontalen Naht etwas oberhalb von Lambda implantiert werden. (C) Die Kopfstange sollte entlang der interfrontalen Naht platziert werden. (D) Tragen Sie Zahnzement auf das Kopfstangenimplantat auf. (E) Tatsächliche Visualisierung der Kopfstange nach dem Auftragen von Zahnzement. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Wasserversorgungssystem mit einer Petrischalen-Fontäne. Eine 60 mm x 15 mm große Petrischale wurde mit der konkaven Seite nach unten auf dem Käfigboden befestigt. Eine kleinere Petrischale von 35 mm x 10 mm wurde auf der größeren Schale zentriert, während eine weitere 60 mm x 15 mm große Petrischale mit der konkaven Seite nach oben auf die Oberseite gestellt wurde, um als Reservoir zu dienen. Dieser Aufbau stellte sicher, dass das Wasser nicht durch Einstreu verunreinigt und für die Mäuse zugänglich blieb. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Richtlinien für die Systemhardware und die Positionierung der Maus. (A) Hier wird das verwendete VR-Setup angezeigt. Es wurde ein Setup mit sechs Bildschirmen verwendet, wobei das kugelförmige Laufband in der Mitte platziert war. (B) Seitenansicht der optimalen Mausplatzierung auf dem kugelförmigen Laufband. Der Mauskopf befindet sich in einer natürlichen Position, während sich alle vier Pfoten auf dem kugelförmigen Laufband befinden. (C) Draufsicht auf die richtige und falsche Platzierung der Maus in Bezug auf die Kopfleiste. Für eine korrekte Platzierung sollte die mittlere Sagittalebene der Maus zentriert sein und nicht die Kopfleiste selbst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Lineare Track-Daten. (A) Die dargestellten Daten zeigen die täglichen Belohnungen, die innerhalb eines 30-minütigen Testzeitraums gesammelt wurden. Mäuse entwickelten sich zu längeren Streckenlängen, sobald sie an 2 aufeinanderfolgenden Tagen durchschnittlich 2 Belohnungen pro Minute erreichten, was insgesamt 60 Belohnungen (Schwellenwert) ergibt. (B) Als die Mäuse die Beherrschung der Aufgabe erlangten, nahmen ihre Geschwindigkeiten allmählich zu, was auf die Wirksamkeit der Belohnungsverstärkung hinweist. Das Diagramm zeigt die durchschnittliche tägliche Geschwindigkeit jeder Maus auf der Strecke in cm/s und zeigt einen linearen Verlauf des erlernten Verhaltens. (C) Dieses Balkendiagramm zeigt die Dauer, die jede Maus benötigt, um Kenntnisse für einzelne Spurlängen zu erwerben, wobei die jeweiligen Mittelwerte und der Standardfehler für jede Spurlänge dargestellt werden. (D) Dieses Balkendiagramm zeigt den Mittelwert und den Standardfehler der durchschnittlichen Tagesgeschwindigkeiten, die von jeder Maus über verschiedene Streckenlängen erreicht werden. Der nahezu lineare Verlauf deutet auf eine erlernte Steigerung der Laufgeschwindigkeit hin. (E) Dies veranschaulicht den Fortschritt der Aufgabe auf der linearen Strecke, die 2 aufeinanderfolgende Testtage mit 60 Belohnungen erfordert, bevor sie zu einer längeren Version des Labyrinths aufsteigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Y-Maze-Daten. (A) Dies zeigt die Verteilung der Belohnungen, die in verschiedenen Stadien des Y-Labyrinth-Fortschritts erworben wurden. Diese Analyse konzentrierte sich ausschließlich auf eine Untergruppe von vier Mäusen, die alle Phasen des linearen Tracks absolvierten, wodurch eine ausgewogene Repräsentation von männlichen und weiblichen Teilnehmern gewährleistet wurde. (B) Diese visuelle Darstellung veranschaulicht die Stadien der Y-Maze-Aufgabe, in denen Mäuse Fortschritte machen, wenn sie an zwei aufeinanderfolgenden Tagen 70% richtige Entscheidungen treffen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In dieser Studie wurde ein umfassender Ansatz zur Untersuchung der Verhaltensreaktionen von Mäusen in VR-Umgebungen verwendet, wobei der Schwerpunkt auf der Implementierung von chirurgischen Eingriffen, Flüssigkeitsrestriktionsprotokollen, dem Systemaufbau und Verhaltensaufgaben lag. Diese Ergebnisse tragen zum Feld bei, indem sie Verfahrensdetails, Zeitrahmen für das Training und Erfolgsquoten liefern. Dies wird eine effektivere Einführung von VR-Verfahren bei Mäusen ermöglichen und die Planung und Umsetzung für Labore erleichtern, die daran interessiert sind, dieses Verfahren in ihrer Forschung einzusetzen.

Die chirurgische Implantation von Kopfbügeln war unerlässlich, um kopffeste Verhaltensexperimente in VR-Umgebungen zu ermöglichen. Durch die sorgfältige Befolgung der etablierten Protokolle und die Bereitstellung einer angemessenen postoperativen Versorgung wurde die erfolgreiche Integration der Kopfstangen sichergestellt und gleichzeitig negative Auswirkungen auf die Gesundheit und das Verhalten der Tiere minimiert. Darüber hinaus wurden Protokolle zur Flüssigkeitsrestriktion implementiert, um die Wasseraufnahme zu regulieren und die Flüssigkeitszufuhr und den Durst der Mäuse aufrechtzuerhalten. Der allmähliche Eingewöhnungsprozess und der regelmäßige Zugang zu Wasser waren entscheidend, um das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten und gleichzeitig die Ausführung von Verhaltensaufgaben zu erleichtern.

Der Aufbau des VR-Verhaltenssystems umfasste die Integration von Hardware- und Softwarekomponenten, um immersive virtuelle Umgebungen für die Mäuse zu schaffen. Die Verwendung von vollständig immersiven virtuellen Displays, flüssigen Belohnungssystemen, Styroporkugeln als kugelförmige Laufbänder und Kopfhalterungen ermöglichte eine präzise Kontrolle über die Versuchsbedingungen und die Datenerfassung. Verhaltensaufgaben, einschließlich der Paradigmen der linearen Spur und des Y-Labyrinths, wurden sorgfältig entwickelt, um Schlüsselaspekte des Mausverhaltens wie Fortbewegung, Entscheidungsfindung und Belohnungsverarbeitung zu untersuchen.

Trotz aller Bemühungen, die experimentellen Verfahren zu optimieren, traten während der Studie mehrere Herausforderungen auf. Die Variabilität der einzelnen Mausreaktionen und technische Probleme im Zusammenhang mit der Hardware- und Softwareintegration stellten eine Herausforderung für die Datenerfassung und -analyse dar. Darüber hinaus erforderte die Abhängigkeit von Flüssigkeitsrestriktionsprotokollen eine sorgfältige Überwachung des Hydratationsstatus des Tieres und eine entsprechende Anpassung der Versuchsverfahren. Manchmal kämpften Mäuse, wenn sie auf den Ball gelegt wurden, tranken nicht aus dem Belohnungsauslauf oder erstarrten und liefen nicht auf dem Ball. Obwohl einige dieser Herausforderungen vorübergehend sein können, ist es wichtig, die Mäuse zu überwachen, um sicherzustellen, dass sie auf ihrem Weg nicht behindert werden. Mäuse, die im Vergleich zu ihren Artgenossen keine Fortschritte zeigen, sollten aus der Studie genommen werden. In einem ähnlichen Experiment wurden 4 von 55 Mäusen entfernt, weil sie nicht in der Lage waren, das Paradigma²⁵ zu lernen. Mäuse, die an 5 aufeinanderfolgenden Tagen eine anhaltende Unbeweglichkeit am Ball zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen, nachdem ihr Gewicht, ihre Fähigkeit, zum Trinken auf den Belohnungsauslauf zuzugreifen, und ihre Positionierung auf dem Ball, um sicherzustellen, dass keine zugrunde liegenden Probleme vorhanden waren, gründlich untersucht wurden. In diesen Fällen liegt es im Ermessen des Forschers, zu entscheiden, welche Strategie er verfolgt, um die Studie effizient fortzusetzen.

Diese Trainingsprotokolle wurden entwickelt, um die Mäuse schrittweise herauszufordern und gleichzeitig sicherzustellen, dass sie Verhaltensaufgaben ausführen können. Die Kriterien für den Übergang von der linearen Spur zum Y-Labyrinth-Paradigma basierten auf der Fähigkeit der Mäuse, vorgegebene Leistungsschwellen zu erreichen, wie z. B. das Erreichen aufeinanderfolgender Tage erfolgreicher Versuche und des Erwerbs von Belohnungen. Die Implementierung strenger Trainingsprotokolle ermöglichte es uns, die Verhaltensfähigkeiten und die Anpassungsfähigkeit der Mäuse an immer komplexere Aufgaben zu bewerten. Diese sorgfältig strukturierten Protokolle bieten Forschern auf dem Gebiet der Verhaltensneurowissenschaften einen robusten Rahmen und bieten einen systematischen Ansatz zur Bewertung und Schulung von Tieren für verschiedene experimentelle Paradigmen. Durch die Festlegung klarer Kriterien für den Fortschritt können Forscher die Lernkurve von Versuchspersonen effizient messen und Trainingsparadigmen entsprechend kuratieren. Darüber hinaus fördert dieser methodische Ansatz die Reproduzierbarkeit und Standardisierung über Experimente hinweg, erleichtert vergleichende Analysen und fördert das Verständnis von kognitiven Prozessen und Lernmechanismen in Tiermodellen.

Bei der Entwicklung eines VR-Paradigmas für Mäuse ist es entscheidend, die Bandbreite der verfügbaren Ansätze in Bezug auf Aufgabenkomplexität und Trainingsfortschritt zu erkennen. Dieses Protokoll bietet einen breiten Rahmen für die Konstruktion eines experimentellen Designs, dennoch bleibt es dem Untersucher überlassen, spezifische Aspekte wie Belohnungsabgabe, Bias-Kontrolle, Stimulustyp, Aufgabenverlauf und Systemparameter an die Bedürfnisse der Studie anzupassen. Einige Studien entscheiden sich beispielsweise für einen schlankeren Ansatz, der sich auf die unmittelbare Aufgabeneinbindung konzentriert. Ein Beispiel ist Krumin et al., die eine einzelne, konsistente T-Maze-Aufgabe implementierten, anstatt ein progressives Lernschema zwischen verschiedenen Aufgaben anzuwenden. Im Gegensatz dazu bieten andere Studien verschiedene Komponenten des Versuchsdesigns an, wie z. B. Stimulusverstärkungsstrategien und auditive Hinweise. Die Studie nutzte auditives Feedback als Bestrafung für fehlerhafte Versuche und gab nur Wasser als Belohnung für korrekte Versuche²⁶. Umgekehrt verwendeten Zhao et al. eine 10%ige Saccharoselösung als Belohnung für korrekte Versuche und beinhalteten keine Form der Bestrafung für fehlerhafte Versuche²⁷. Stattdessen konzentrierten sie sich darauf, falsche Reaktionen durch Methoden wie Anti-Bias-Training zu mildern, bei denen die Wahrscheinlichkeit erhöht wurde, dass der Hinweis von der vorherigen Wahl des Tieres abweicht, und die tägliche Wasserzufuhr angepasst wurde, um die Motivation zu steigern. Unterschiede im experimentellen Design, wie z.B. das Vorhandensein von räumlichen Hinweisen während der gesamten Aufgabe, können zu unterschiedlichen Interpretationen der neuronalen Kodierung führen, wie Zhao et al. zeigten, die eine posteriore Selektivität der parietalen Kortexzellen fanden, die durch Trajektorien und räumliche Präferenzen erklärt wurde, im Gegensatz zu den von Harvey et al. beobachteten wahlabhängigen Aktivierungssequenzen^27,28. Es ist wichtig zu beachten, dass die speziell verwendete Hardware sechs LCD-Monitore, einen ausziehbaren Leckauslauf und ein luftgepolstertes Styropor-Balllaufband umfasste. Es gibt eine Reihe von Unterschieden zwischen Virtual-Reality-Systemen und Laboren, einschließlich der Verwendung von Projektoren²⁹ im Vergleich zu Computermonitoren, nicht-sphärischen Laufbändern³⁰ und festen¹⁰ im Vergleich zu ausziehbaren Ausläufen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie wertvolle Einblicke in die Verhaltensreaktionen von Mäusen in VR-Umgebungen liefert und die Machbarkeit des Einsatzes immersiver Technologie zur Untersuchung komplexer Verhaltensweisen zeigt. Zukünftige Forschungsvorhaben könnten sich auf die Verfeinerung experimenteller Protokolle, die Erforschung neuronaler Mechanismen, die Entscheidungsprozessen zugrunde liegen, und die Umsetzung von Erkenntnissen in klinische Anwendungen konzentrieren. Indem sie das Verständnis des Verhaltens von Mäusen weiter verbessern, können Wissenschaftler die neuronalen Schaltkreise und kognitiven Prozesse, die komplexen Verhaltensweisen sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit zugrunde liegen, weiter aufklären.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube