Co-Kulturmodell mit zwei Arten von adhärenten Zelllinien

Zusammenfassung

Das Protokoll zeigt ein neuartiges experimentelles In-vitro-Modell , das die Biologie von zwei Arten von adhärenten Zelllinien mit einem dreidimensionalen (3D)-gedruckten Gerüst rekapitulieren kann. Der Aufbau dieses Modells und die Arbeitsabläufe, von der Zellpräparation über die Zellkultur bis hin zur Analyse und Auswertung, werden beschrieben.

Zusammenfassung

Die Einnistung des Embryos wird durch die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen in der Mutter-Embryo-Schnittstelle beeinflusst. Die direkte und indirekte Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der Dezidua ist entscheidend für die Regulierung der Empfänglichkeit des Endometriums; Die molekularen Mechanismen, die diese Wechselwirkung vermitteln, sind jedoch noch unklar. In diesem Zusammenhang wird ein Modell zur Untersuchung des Implantationsprozesses benötigt, um ein umfassendes In-vitro-Modell zu etablieren, das die Biologie der Interaktion zwischen Endometriumepithel und Stroma rekapitulieren kann. Dieses Modell besteht aus regulären Zellkulturplatten und einem passenden Gerüst, das durch dreidimensionalen (3D) Druck aus kostengünstigen Materialien erzeugt wird. Im Folgenden stellen wir eine Reihe von Protokollen für die Modellkonstruktion, die Zellvorbereitung, die Zellaussaat, die Zellkultur, die Beobachtung und die Bewertung vor. Darüber hinaus haben wir repräsentative Ergebnisse mit Zellen unter dem Mikroskop einbezogen, die gute Wachstumsbedingungen aufweisen. Ziel dieser Studie war es, In-vitro-Modelle zu entwickeln, die die Interaktion zwischen endometrialen Stromazellen und Epithelzellen sowie zwischen Trophoblastzellen und Endometriumzellen nachahmen.

Einleitung

Trotz umfangreicher Forschung über die Schwangerschaft beim Menschen sind die molekularen Mechanismen an der Schnittstelle zwischen Mutter und Fötus während der Implantation und der frühen Schwangerschaft nach wie vor wenig verstanden¹. Das menschliche Endometrium besteht hauptsächlich aus zwei Zelltypen: Endometriumepithelzellen (EECs) und Endometriumstromazellen (ESCs). Die Einnistung verläuft in drei Phasen: Apposition, Anheftung und Invasion, die zur Entwicklung eines kompetenten Embryos und eines rezeptiven Endometriums führen². In Anbetracht der ethischen Zwänge von In-vivo-Studien an menschlichen Probanden sowie der Schwierigkeiten bei der vollständigen Simulation des menschlichen Zustands bei Tieren ist die Konstruktion von In-vitro-Modellen für menschliche Endometriumkulturen zu einem wirksamen Mittel geworden, um die Einnistungs- und Frühschwangerschaftsprozesse zu replizieren³. Diese Modelle sind wertvoll für die Untersuchung sowohl normaler als auch pathologischer Schwangerschaften und bieten eine grundlegende Plattform für die vorläufige Erprobung und Validierung therapeutischer Interventionen in der translationalen Medizin.

Kommerzielle Kammern sind in der zellbiologischen Forschung weit verbreitet. Diese Kammern bieten wertvolle Einblicke in die Zellmigration und die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen. Kommerzielle Kammern sind jedoch in der Regel für den einmaligen Gebrauch bestimmt und können kostspielig sein⁴.

Eine große Anzahl von In-vitro-Humankulturmodellen, bestehend aus Endometrium und Blastozyste oder Blastozysten-Surrogaten, wurde entwickelt, um den detaillierten Prozess der Implantation besser zu verstehen. Diese Modelle befinden sich jedoch noch in der Anfangsphase ihrer Anwendung, da die 3D-Struktur ein hochkomplizierter Versuchsaufbau ist und bestimmte spezifische Differenzierungsmedien teuer sind ^5,6,7.

Die Verwendung von erschwinglicher 3D-Druck-Hardware und eine relativ kurze Fertigungszeit ermöglichen es, Strukturen für verschiedene experimentelle Zwecke anzupassen. 3D-Drucktechniken helfen, Zeitkosten zu reduzieren und ermöglichen die Erstellung komplexer, kundenspezifischer Strukturen. Diese Technologie beschleunigt das Design und die Iteration von Prototypen erheblich und ist damit ein wertvolles Werkzeug für Forscher in verschiedenen Bereichen, das es ihnen ermöglicht, ihre Arbeit effizienter zu erledigen ^8,9,10.

In dieser Arbeit stellen wir ein praktikables und wirtschaftliches Versuchsprotokoll für die Konstruktion der 3D-Struktur und ihre Verwendung als Zellkultursystem vor, das die Interaktion zwischen endometrialen Stroma- und Epithelzellen simulieren kann, um die Empfänglichkeit des Endometriums während der Embryoimplantation zu untersuchen. Dies bietet eine anpassbare und kostengünstige Alternative für kommerzielles Einwegmaterial.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C voräquilibriert.

1. 3D Druck des Gerüsts und Modellbau

HINWEIS: Die Schritte hier wurden gemäß dem Handbuch der kommerziellen 3D-Metalldruckmaschine durchgeführt. Die Schritte werden im Folgenden kurz beschrieben (Ergänzungsdatei 1).

1. Druckbett Nivellierung
   1. Tippen Sie auf das Menüsymbol im Dashboard und navigieren Sie zu Dienstprogramme. Wählen Sie Bed Level aus, um die Nivellierungsroutine zu starten.
   2. Entfernen Sie das Druckblatt aus dem Druckbett und wählen Sie Fertig. Das Druckbett steigt zur Vorbereitung der Nivellierung auf seine maximale Höhe an. Sobald der Fortschrittsbalken 100 % erreicht, drücken Sie Start.
   3. Wenn der Metal X-Drucker noch nicht nivelliert wurde, wählen Sie Zurücksetzen. Wenn dies der Fall ist, wählen Sie Überspringen und fahren Sie direkt mit Schritt 1.1.5 (dem 16-Punkt-Scan) fort.
   4. Drehen Sie mit einem 2,5-mm-Inbusschlüssel alle Nivellierschrauben mit drei Betten im Uhrzeigersinn, bis sie fest angezogen sind. Lockern Sie sie dann, indem Sie sie zwei volle Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn drehen, um sie auf eine mittlere Höhe zu bringen. Drücken Sie Fertig , um fortzufahren.
   5. Der Drucker scannt das Bett an 16 festgelegten Punkten. Berühren Sie während dieses Vorgangs nicht das Bett oder den Rahmen. Sobald der Fortschritt 100 % erreicht hat, drücken Sie auf Weiter.
2. Bogen drucken
   1. Entfernen Sie alle Metallreste oder Stützreste. Schalten Sie den Schieberegler Vakuum auf Ein.
   2. Lassen Sie das Bett absenken und aufheizen, und drücken Sie dann auf Weiter. Legen Sie das Druckblatt über das Vakuumgitter und drücken Sie Weiter.
   3. Positionieren Sie die Bogenpresse über dem Druckbogen und richten Sie sie an den Z-Schienen an der Rückseite der Kammer aus.
   4. Warten Sie, bis das Vakuum einrastet und eine stabile Abdichtung entsteht. Sobald das Vakuum eingeschaltet ist, drücken Sie Fertig.
3. Laden von Metallfilamenten
   1. Positionieren Sie den Druckkopf manuell in der Mitte des Druckbereichs. Entferne die Druckkopfabdeckung, indem du sie nach oben und von den Befestigungsschrauben schiebst.
   2. Tippen Sie auf das Menüsymbol auf der Optionstafel. Wählen Sie Materialien aus den Optionen aus.
   3. Wählen Sie Load Metal , um die Laderoutine zu starten. Wählen Sie Quick Load aus.
   4. Wählen Sie die spezifische Art des zu ladenden Metallmaterials aus (z. B. Aluminium 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Legen Sie die Spule auf die Halterung und drücken Sie Weiter. Schließen Sie die Klappe, lassen Sie die Spulen aufwärmen, und drücken Sie dann auf Weiter.
   6. Führen Sie das Material in den vorderen Einlass des Druckkopfs (mit M gekennzeichnet) ein, bis der Extruder beginnt, es durchzuziehen.
4. Druck von Metallteilen
   1. Klicken Sie im Bedienfeld "Druckeinstellungen" auf "Gebäude d exportieren". Speichern Sie die Datei auf einem USB-Laufwerk, das mit FAT32 formatiert ist, und stecken Sie sie in den Drucker.
   2. Wählen Sie das Menüsymbol auf dem Board aus. Navigieren Sie zu Speicher und wählen Sie Aus Speicher drucken aus. Wählen Sie die Teiledatei aus, um den Druck zu starten.
5. Entfernen von Metallteilen
   1. Schiebe den Druckbogen und die gedruckten Teile vorsichtig vom Druckbett. Lösen Sie die Teile vorsichtig vom Druckbogen. Das flexible Blatt sollte sich leicht ablösen lassen.

2. Vorbereitung für die Zell-Co-Kultur im 3D-Modell

HINWEIS: Es wird empfohlen, hochtemperaturbeständige Materialien als Verbrauchsmaterialien für den 3D-Druck von Gerüststützen für Zelldeckgläser zu verwenden, um die Sterilisation im Autoklaven vor jedem Einsatz in Zellkulturexperimenten zu erleichtern. In dieser Studie wurden immortalisierte humane endometriale Stromazellen (HESC) und humane endometriale Epithelzellen (Ishikawa) verwendet. Über die Charakterisierung dieser Zelllinien wurde bereits berichtet ^5,6.

1. Zellkultur und Passage
   1. Bereiten Sie 50 ml komplementäres Medium für hESC vor, indem Sie DMEM/F12-Medium + 2 mM L-Glutamin + 10 % kohlegestreiftes fötales Rinderserum (FBS) + 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung hinzufügen.
   2. Bereiten Sie 50 ml komplementäres Medium für Ishikawa vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin Lösung hinzufügen.
   3. Auftauen der Zellen
      HINWEIS: Die gekaufte Zelllinie wurde auf Trockeneis in gefrorenem Zustand versendet. Es sollte in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff oder unter -130 °C gelagert werden.
      1. Bereiten Sie alle erforderlichen sterilisierten Geräte und Dissoziationsenzyme vor und erwärmen Sie das komplementäre Medium auf 37 °C.
      2. Tauen Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad mit gelegentlichem leichtem Wiegen zügig auf. Die Zellsuspension wird in ein Röhrchen mit 5 mL Basalkulturmedium überführt und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.
      3. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Das Zellpellet wird in 5 mL des vorbereiteten vollständigen Kulturmediums resuspendiert und in zwei T25-Kulturflaschen abgefüllt. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
2. Vorbereitung der Zellen mit einem Deckglas
   1. Verwenden Sie ein quadratisches Deckglas von 18 mm als Oberfläche der Zellkultur. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas sauber und steril ist.
   2. Beschichten Sie das Deckglas am Boden einer 12-Well-Platte mit 200 μl extrazellulärer Matrix (ECM) in einer Konzentration von 200-300 μg/ml. Halten Sie die Platte 1 h lang bei 37 °C.
   3. Entfernen Sie das ECM von der Platte. Untersuchen Sie die Zellen auf angemessene Konfluenz und stellen Sie sicher, dass die Dichte beider Zelllinien etwa 70 % bis 80 % beträgt.
   4. Entfernen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen 2x mit 3 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   5. Fügen Sie 2 ml Dissoziationsenzym hinzu und kultivieren Sie die Zellen 2 Minuten lang bei 37 °C, um sie abzulösen.
   6. Neutralisieren Sie mit vollständigem Kulturmedium und erzeugen Sie eine Einzelzellsuspension durch Auf- und Abpipettieren.
   7. Nehmen Sie 100 μl der Zellsuspension und mischen Sie sie mit Trypanblau (Verdünnungsfaktor = 2).
   8. Schieben Sie das Deckglas über die Kammer des Hämozytometers. Füllen Sie beide Seitenkammern mit der Zellsuspension, die Trypanblau enthält.
   9. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in Quadraten auf beiden Seiten unter einem 20-fach-Mikroskop und berechnen Sie die Dichte der Zellen.
   10. Die Zellen werden auf die vorbereitete Platte mit frischem Medium umgefüllt und bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Seed-hESC in der Vertiefung mit 1 x 10⁵ Zellen/ml für 24 h.
   11. Für die Ishikawa-Zelllinie säen Sie die Zelle am nächsten Tag ohne Deckglas in die Vertiefung.

3. Aufbau des Co-Kultur-Modells

1. Weichen Sie die Gerüste 2 Tage lang gründlich mit Ethylalkohol und doppelt destilliertem Wasser (ddw) ein. Gerüste mit einem Autoklaven bei 121 °C sterilisieren und trocknen.
2. Geben Sie etwa 2 ml komplementäres Medium für die Ishikawa-Zelllinie in das gut kultivierende Ishikawa und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand das Deckglas bedeckt.
3. Übertragen Sie die Deckglasabdeckung mit hESC auf das Gerüst und halten Sie die Seite mit der Zelle nach unten. Stecken Sie das Gerüst in den gut kultivierenden Ishikawa. Für den zweiten Satz kehren Sie diese Anordnung um, indem Sie den Deckglasbezug mit Ishikawa auf das Gerüst übertragen und das Gerüst in den gut kultivierenden hESC stecken. Verwenden Sie die Zellen ohne Gerüstaufbau für die Analyse des unabhängig wachsenden Zellwachstums.
4. Inkubieren Sie das Co-Kultursystem bei 37 °C, 5 % CO₂. Die Co-Kultur-Periode kann je nach Versuchsdesign variieren, liegt aber typischerweise zwischen 24 und 72 Stunden.

4. Bilderfassung

1. Entfernen Sie vorsichtig das Nährmedium und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
2. Deckgläser mit anhaftenden Zellen mit einer feinen Pinzette oder Pinzette aus Kulturschalen entfernen. Legen Sie optional Deckgläser in eine neue Schale mit PBS, um ein Austrocknen während des Transfers zu verhindern.
3. Nehmen Sie einen sauberen Objektträger und geben Sie einen Tropfen PBS. Übertragen Sie das Deckglas mit den Zellen vorsichtig auf den Tropfen Eindeckmedium und stellen Sie sicher, dass die Zellen mit der Vorderseite nach unten auf den Objektträger zeigen.
4. Legen Sie den vorbereiteten Objektträger auf den Tisch des inversen Mikroskops. Wählen Sie das passende Objektiv (z. B. 10x, 20x) und stellen Sie den Fokus mit den Grob- und Feinfokusknöpfen ein.
5. Stellen Sie Mikroskopparameter wie Beleuchtungsintensität und Kameraeinstellungen ein. Nehmen Sie mit der Mikroskopsoftware Bilder der Zellen in den gewünschten Vergrößerungen und Sichtfeldern auf. Passen Sie die Belichtungszeit und andere Bildeinstellungen an, um die Bildqualität zu optimieren.

5. Bildverarbeitung

1. Klicken Sie auf Öffnen , um das Bild zu öffnen, klicken Sie auf Prozess > Filter > Verbesserung, um > Lokale Entzerrung auszuwählen, und klicken Sie auf Übernehmen.
2. Klicken Sie auf Bearbeiten > In > Graustufen 8 konvertieren. Klicken Sie auf "Verbessern" und wählen Sie "Kontrast anwenden" aus.
3. Klicken Sie auf Fächer zählen und messen. Klicken Sie auf Manuell, wählen Sie einen Bereich aus und passen Sie das Histogramm an, um sicherzustellen, dass alle Zellen abgedeckt sind.
4. Klicken Sie auf Maske anwenden, schließen Sie das aktuelle Fenster, klicken Sie auf Automatische helle Objekte > Messen, wählen Sie Messung aus und wählen Sie Aera, Dendric, Density und Size.
5. Klicken Sie auf "Automatisch helle Objekte" und dann auf "Anzahl". Klicken Sie auf Daten exportieren , um die Messdaten in eine Tabelle zu exportieren.

6. Zellernte

1. Entfernen Sie die Deckgläser vom Objektträger und geben Sie sie in eine saubere und trockene Vertiefung.
2. Ernten Sie die Ishikawa-Zelle mit einem RNA-Isolationsreagenz für die Transkriptomik oder einem Ripa-Lysereagenz für die Proteomforschung.
   HINWEIS: Bei hESC war die Deckglas-Kulturmethode für die Bildaufnahme nach Immunfärbung effektiver. Alternativ kann das hES-Protein mit einem RNA-Isolationsreagenz oder einem Ripa-Lysereagenz geerntet werden. Zelllinien, die auf dem Deckglas oder der Oberfläche der Platte kultiviert wurden, könnten ausgetauscht werden; Wir empfehlen jedoch, die für die bildgebende Analyse vorbereiteten Zellen auf das Deckglas zu säen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das hausgemachte Gerüst für Zellobjektträger, das in diesem Prozess verwendet wird, das aus einem oberen Stützring besteht, der auf die Befestigung an Standard-12-Well-Zellkulturplatten zugeschnitten ist, ergänzt durch einen basalen Zellträgerhalter mit vier L-förmigen stabförmigen Strukturen.

Laut Abbildung 2 blieb die Dichte beider Zelltypen in der Kokulturbedingung (

Diskussion

Für die indirekte Co-Kultur von endometrialen Stroma- und Epithelzellen wird ein vereinfachtes und kostengünstiges Protokoll beschrieben. Bei dieser Methode wird ein hausgemachtes Gerüst für Zellobjektträger verwendet, das aus einem oberen Stützring besteht, der auf die Befestigung an Standard-12-Well-Zellkulturplatten zugeschnitten ist, ergänzt durch einen Basalzellträgerhalter mit vier L-förmigen stabförmigen Strukturen. Dieser Aufbau erleichtert die Trennung von endometriale...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme