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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Repräsentative Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Züchtung resistenter Stärkereissorten durch Design unter Verwendung von Genome-Editing-Technologien auf präzise, effiziente und technisch einfache Weise.

Zusammenfassung

Die konventionellen Ansätze der Pflanzenzüchtung, die überwiegend auf zeit- und arbeitsintensiven Methoden wie der traditionellen Hybridisierung und Mutationszüchtung beruhen, stehen vor Herausforderungen, wenn es darum geht, gezielte Merkmale effizient einzuführen und vielfältige Pflanzenpopulationen zu erzeugen. Umgekehrt hat das Aufkommen von Genome-Editing-Technologien einen Paradigmenwechsel eingeleitet, der eine präzise und beschleunigte Manipulation von Pflanzengenomen ermöglicht, um gewünschte Eigenschaften absichtlich einzuführen. Eines der am weitesten verbreiteten Bearbeitungswerkzeuge ist das CRISPR/Cas-System, das von Forschern verwendet wird, um wichtige biologische Probleme zu untersuchen. Der präzise und effektive Arbeitsablauf der Genom-Editierung ist in der Pflanzenzüchtung jedoch noch nicht genau definiert. In dieser Studie haben wir den gesamten Prozess der Züchtung von Reissorten demonstriert, die mit einem hohen Anteil an resistenter Stärke (RS) angereichert sind, einem funktionellen Merkmal, das eine entscheidende Rolle bei der Vorbeugung von Krankheiten wie Diabetes und Fettleibigkeit spielt. Der Arbeitsablauf umfasste mehrere wichtige Schritte, wie z. B. die Auswahl des funktionellen SBEIIb-Gens , das Design der Single-Guide-RNA (sgRNA), die Auswahl eines geeigneten Genom-Editing-Vektors, die Bestimmung der Vektorverabreichungsmethode, die Durchführung von Pflanzengewebekulturen, die Genotypisierung, die Mutation und die phänotypische Analyse. Darüber hinaus wurde der Zeitrahmen, der für jede Phase des Prozesses erforderlich ist, klar aufgezeigt. Dieses Protokoll rationalisiert nicht nur den Züchtungsprozess, sondern verbessert auch die Genauigkeit und Effizienz der Einführung von Merkmalen und beschleunigt so die Entwicklung funktioneller Reissorten.

Einleitung

Die traditionelle Züchtung beruht auf der Einführung von Merkmalen in Kulturpflanzen oder der Erzeugung von Pflanzenpopulationen mit ausreichender Variation, was eine langfristige Feldbeobachtung erfordert 1,2. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen Züchtung wurde eine Gen-Editing-Technologie entwickelt, die das Genom von Nutzpflanzen präzise modifizieren kann, um die gewünschten Merkmale von Pflanzenpopulationen zu erhalten3. Das am weitesten verbreitete Gen-Editing-System in Pflanzen ist CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palin....

Protokoll

Die Studie wurde bei Bellagen Biotechnology Co. Ltd in China nach den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung durchgeführt. Vor der Teilnahme wurde den Probanden das Studienprotokoll ausführlich erklärt, und sie gaben ihre Einverständniserklärung ab.

1. Design der sgRNA und des Konstruktionsvektors (Zeit: 5-7 Tage)

HINWEIS: Zur Expression des CRISPR/Cas-SF01-Systems21 wurde ein binärer Vektor verwendet. Sie dürfen nicht weniger als 3 Nukleotide (nt) mit einer potenziellen Off-Target-Stelle für sgRNA nicht übereinstimmen. Der s....

Repräsentative Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wurden alle Verfahren der Züchtung von funktionellem Reis durch Genome Editing demonstriert, um stabile resistente Stärkereissorten zu erhalten. Wir integrierten sgRNA, die auf SBEIIb abzielt, in CRISPR/Cas-SF01 (Ergänzende Abbildung 1), infiltrierten Reis mittels Agrobacterium-Transformation und erhielten nach Screening- und Bewurzelungsphasen Pflanzen zur E0-Generation. Pflanzen mit Verlust der Genfunktion wurden gescreen.......

Diskussion

Bei der Konstruktion von CRISPR/Cas-SF01-basierten Knockdown-Vektoren ist die sorgfältige Auswahl von Single-Guide-RNAs (sgRNA) von entscheidender Bedeutung. Dies erfordert die Verwendung von Sequenzen, die eine hohe Bearbeitungseffizienz mit minimalen Off-Target-Effekten aufweisen. Darüber hinaus enthält die Synthese von Targeting-Primern kurze Adapter-Oligos, die zu den Spleißstellen des Vektors passen, um eine nahtlose Integration zu gewährleisten. Im Gegensatz zu früheren Metho.......

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2 x Taq Plus Master Mix IIVazyme Biotech Co.,LtdP213 Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid SolutioPhyto TechnologyD309
AAM mediumShandong Tuopu Biol-engineering Co., LtdM9051C
BsaI-HFNew england biolabsR3535Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibioticsApplygenAPC8250-5Selection  medium, regeneration medium
CasaminoacidBBI-Life SciencesCorporationA603060-0500Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent CellWeidi Biotechnology Co., Ltd.DL1001E. coli competent cells
D-SorbitolBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrateDiamondA100105-0500CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent CellWeidi Biotechnology Co., Ltd.AC1010Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini KitVazyme Biotech Co.,LtdREC01-100Plasmid isolated
Hygromycin antibioticsYeasen60224ESco-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibioticsYeasen60206ES10Selection agrobacterium
KOHMacklinP766798CTAB buffer
L-GlutaminePhyto TechnologyG229Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-ProlinePhyto TechnologyP698Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)--Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechineMARUMASUMHR1500ATo produce white rice
Murashige SkoogPhyto TechnologyM519Root medium, regeneration medium
Myo-inositolPhyto TechnologyI703Regeneration medium
NaClMacklinS805275For  YEP media
NB Basal MediumPhyto TechnologyN492Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone SolarbioLA8800For  YEP media
PhytogelShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24793
Pot Midea group Co.MB-5E86For cooking rice
RefrigeratorHaierBCD-170Storage the medium
Resistant Starch Assay KitMegazymeK-RSTARMeasurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibioticsSigmaR3501-250MGSelection agrobacterium
Sodium hypochlorite solutionMacklinS817439For seed sterilization
SucroseShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB21647Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA LigaseNew england biolabsM0202Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitorMedical Equipment & Supply Co., LtdXuetang 582Detection the blood glucose
Tris-HCLMacklinT766494CTAB buffer
Yeast AgarSolarbioLA1370For  YEP media
YEP media--Cultivation of Agrobacterium

Referenzen

  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplina....

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