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Das Protokoll beschreibt die Züchtung resistenter Stärkereissorten durch Design unter Verwendung von Genome-Editing-Technologien auf präzise, effiziente und technisch einfache Weise.
Die konventionellen Ansätze der Pflanzenzüchtung, die überwiegend auf zeit- und arbeitsintensiven Methoden wie der traditionellen Hybridisierung und Mutationszüchtung beruhen, stehen vor Herausforderungen, wenn es darum geht, gezielte Merkmale effizient einzuführen und vielfältige Pflanzenpopulationen zu erzeugen. Umgekehrt hat das Aufkommen von Genome-Editing-Technologien einen Paradigmenwechsel eingeleitet, der eine präzise und beschleunigte Manipulation von Pflanzengenomen ermöglicht, um gewünschte Eigenschaften absichtlich einzuführen. Eines der am weitesten verbreiteten Bearbeitungswerkzeuge ist das CRISPR/Cas-System, das von Forschern verwendet wird, um wichtige biologische Probleme zu untersuchen. Der präzise und effektive Arbeitsablauf der Genom-Editierung ist in der Pflanzenzüchtung jedoch noch nicht genau definiert. In dieser Studie haben wir den gesamten Prozess der Züchtung von Reissorten demonstriert, die mit einem hohen Anteil an resistenter Stärke (RS) angereichert sind, einem funktionellen Merkmal, das eine entscheidende Rolle bei der Vorbeugung von Krankheiten wie Diabetes und Fettleibigkeit spielt. Der Arbeitsablauf umfasste mehrere wichtige Schritte, wie z. B. die Auswahl des funktionellen SBEIIb-Gens , das Design der Single-Guide-RNA (sgRNA), die Auswahl eines geeigneten Genom-Editing-Vektors, die Bestimmung der Vektorverabreichungsmethode, die Durchführung von Pflanzengewebekulturen, die Genotypisierung, die Mutation und die phänotypische Analyse. Darüber hinaus wurde der Zeitrahmen, der für jede Phase des Prozesses erforderlich ist, klar aufgezeigt. Dieses Protokoll rationalisiert nicht nur den Züchtungsprozess, sondern verbessert auch die Genauigkeit und Effizienz der Einführung von Merkmalen und beschleunigt so die Entwicklung funktioneller Reissorten.
Die traditionelle Züchtung beruht auf der Einführung von Merkmalen in Kulturpflanzen oder der Erzeugung von Pflanzenpopulationen mit ausreichender Variation, was eine langfristige Feldbeobachtung erfordert 1,2. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen Züchtung wurde eine Gen-Editing-Technologie entwickelt, die das Genom von Nutzpflanzen präzise modifizieren kann, um die gewünschten Merkmale von Pflanzenpopulationen zu erhalten3. Das am weitesten verbreitete Gen-Editing-System in Pflanzen ist CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palin....
Die Studie wurde bei Bellagen Biotechnology Co. Ltd in China nach den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung durchgeführt. Vor der Teilnahme wurde den Probanden das Studienprotokoll ausführlich erklärt, und sie gaben ihre Einverständniserklärung ab.
1. Design der sgRNA und des Konstruktionsvektors (Zeit: 5-7 Tage)
HINWEIS: Zur Expression des CRISPR/Cas-SF01-Systems21 wurde ein binärer Vektor verwendet. Sie dürfen nicht weniger als 3 Nukleotide (nt) mit einer potenziellen Off-Target-Stelle für sgRNA nicht übereinstimmen. Der s....
In der vorliegenden Studie wurden alle Verfahren der Züchtung von funktionellem Reis durch Genome Editing demonstriert, um stabile resistente Stärkereissorten zu erhalten. Wir integrierten sgRNA, die auf SBEIIb abzielt, in CRISPR/Cas-SF01 (Ergänzende Abbildung 1), infiltrierten Reis mittels Agrobacterium-Transformation und erhielten nach Screening- und Bewurzelungsphasen Pflanzen zur E0-Generation. Pflanzen mit Verlust der Genfunktion wurden gescreen.......
Bei der Konstruktion von CRISPR/Cas-SF01-basierten Knockdown-Vektoren ist die sorgfältige Auswahl von Single-Guide-RNAs (sgRNA) von entscheidender Bedeutung. Dies erfordert die Verwendung von Sequenzen, die eine hohe Bearbeitungseffizienz mit minimalen Off-Target-Effekten aufweisen. Darüber hinaus enthält die Synthese von Targeting-Primern kurze Adapter-Oligos, die zu den Spleißstellen des Vektors passen, um eine nahtlose Integration zu gewährleisten. Im Gegensatz zu früheren Metho.......
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074) unterstützt.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 x Taq Plus Master Mix II | Vazyme Biotech Co.,Ltd | P213 | Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes |
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio | Phyto Technology | D309 | |
AAM medium | Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd | M9051C | |
BsaI-HF | New england biolabs | R3535 | Bsa I enzyme digestion of the editing vector |
Carbenicillin antibiotics | Applygen | APC8250-5 | Selection medium, regeneration medium |
Casaminoacid | BBI-Life SciencesCorporation | A603060-0500 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
DH5α Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | DL1001 | E. coli competent cells |
D-Sorbitol | BBI-Life SciencesCorporation | A610491-0500 | |
EDTA,disodium salt,dihydrate | Diamond | A100105-0500 | CTAB buffer |
EHA105 Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | AC1010 | Agrobacterium competent cells |
FastPure Plasmid Mini Kit | Vazyme Biotech Co.,Ltd | REC01-100 | Plasmid isolated |
Hygromycin antibiotics | Yeasen | 60224ES | co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium |
Kanamycin antibiotics | Yeasen | 60206ES10 | Selection agrobacterium |
KOH | Macklin | P766798 | CTAB buffer |
L-Glutamine | Phyto Technology | G229 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
L-Proline | Phyto Technology | P698 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) | - | - | Japonica varieties for breeding RS rice |
Mill rice mechine | MARUMASU | MHR1500A | To produce white rice |
Murashige Skoog | Phyto Technology | M519 | Root medium, regeneration medium |
Myo-inositol | Phyto Technology | I703 | Regeneration medium |
NaCl | Macklin | S805275 | For YEP media |
NB Basal Medium | Phyto Technology | N492 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Peptone | Solarbio | LA8800 | For YEP media |
Phytogel | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S24793 | |
Pot | Midea group Co. | MB-5E86 | For cooking rice |
Refrigerator | Haier | BCD-170 | Storage the medium |
Resistant Starch Assay Kit | Megazyme | K-RSTAR | Measurement and analysis resistant starch |
Rifampicin antibiotics | Sigma | R3501-250MG | Selection agrobacterium |
Sodium hypochlorite solution | Macklin | S817439 | For seed sterilization |
Sucrose | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | B21647 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
T4 DNA Ligase | New england biolabs | M0202 | Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector |
The glucose monitor | Medical Equipment & Supply Co., Ltd | Xuetang 582 | Detection the blood glucose |
Tris-HCL | Macklin | T766494 | CTAB buffer |
Yeast Agar | Solarbio | LA1370 | For YEP media |
YEP media | - | - | Cultivation of Agrobacterium |
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