Nutzung der Kraft von microRNA-Ladungen in kleinen extrazellulären Vesikel, die aus frisch gefrorenen menschlichen Gehirnabschnitten freigesetzt werden

Zusammenfassung

Hier etablieren wir ein Protokoll mit minimalen Mengen an frisch gefrorenen Hirngewebeschnitten und einer zugänglichen Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsmethode in Verbindung mit Größenausschlusschromatographie, um kleine extrazelluläre Vesikel als Quellen für microRNA (miRNA)-Biomarker für neurologische Erkrankungen zu gewinnen.

Zusammenfassung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind wichtige Mediatoren der Zell-Zell-Kommunikation und transportieren verschiedene Frachten wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren (microRNA, mRNA, DNA). Die microRNA-sEV-Fracht hat einen potenziellen Nutzen als leistungsstarker nicht-invasiver Biomarker für Krankheiten, da sEV biologische Barrieren (z. B. die Blut-Hirn-Schranke) überwinden und durch verschiedene Körperflüssigkeiten zugänglich werden kann. Trotz zahlreicher Studien zu sEV-Biomarkern in Körperflüssigkeiten bleibt die Identifizierung von gewebe- oder zellspezifischen sEV-Subpopulationen, insbesondere aus dem Gehirn, eine Herausforderung. Unsere Studie geht diese Herausforderung an, indem sie bestehende Methoden zur Isolierung von sEVs aus minimalen Mengen gefrorener menschlicher Gehirnschnitte mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) anpasst.

Nach der ethischen Genehmigung wurden etwa 250 μg frisch gefrorenes menschliches Hirngewebe (von der Manchester Brain Bank [UK]) aus den 3 Spendergeweben geschnitten und in Kollagenase Typ 3/Hibernate-E-Lösung inkubiert, mit Zwischenrührung, gefolgt von seriellen Zentrifugations- und Filtrationsschritten. Anschließend wurden die sEVs mit der SEC-Methode isoliert und unter Befolgung der MISEV-Richtlinien charakterisiert. Vor der Isolierung von RNA aus diesen sEVs wurde die Lösung mit Proteinase-K und RNase-A behandelt, um extrazelluläre RNA ohne sEV zu entfernen. Die RNA-Menge und -Qualität wurden für qPCR- und Small-RNA-Sequenzierungsexperimente überprüft und weiterverarbeitet.

Das Vorhandensein von sEVs wurde durch Fluoreszenz-Nanopartikel-Tracking-Analyse (fNTA) und Western Blot für Oberflächenmarker (CD9, CD63, CD81) bestätigt. Die Größenverteilung (50-200 nm) wurde durch NTA und Elektronenmikroskopie bestätigt. Die Gesamt-RNA-Konzentration in lysierten sEVs lag im Bereich von 3-9 ng/μL und wurde für die erfolgreiche Quantifizierung ausgewählter microRNA-Kandidaten mittels qPCR verwendet. Die Small-RNA-Sequenzierung auf MiSeq lieferte qualitativ hochwertige Daten (Q >32) mit 1,4-5 Millionen Reads pro Probe.

Diese Methode ermöglicht die effiziente Isolierung und Charakterisierung von sEVs aus minimalen Hirngewebevolumina, erleichtert die nicht-invasive Biomarkerforschung und ist vielversprechend für gerechte Biomarker-Studien, die Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen und potenziell andere Erkrankungen bieten.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind einer der Hauptakteure der interzellulären Kommunikation in allen mehrzelligen Organismen¹. EVs sind aus Zellen gewonnene Lipid-Doppelschicht-Membranpartikel, die die Übertragung einer Vielzahl von Frachtladungen wie Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren auf Empfängerzellen erleichtern können. EVs können einen breiten Größenbereich von 30 nm bis 1 μM haben. Kleine EVs (sEVs), definiert als lipidgebundene Vesikel mit einer durchschnittlichen Durchmessergröße von <200 nm, haben die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden; Daher wurden sie mit der prionenartigen Ausbreitung und Verschlimmerung von neurodegenerativen Erkrankungen und anderen Erkrankungen wie Alzheimer (AD), frontotemporaler Demenz (FTD), Parkinson (PD) und Krebs in Verbindung gebracht ^2,3. Da sEVs in einer Reihe von Bioflüssigkeiten wie Blut, Liquor cerebrospinalis (CSF), Speichel und sogar Urin zu finden sind, kann sich ihr vorteilhafter Nutzen über den Bereich der Biomarker und der nicht-invasiven Diagnostik erstrecken. Zum Beispiel könnte die AD-Forschung auf die Verwendung von biofluiden pathogenen Proteinverhältnissen wie tau/Aβ oder sogar Aβ₄₂/Aβ₄₀⁴ hinweisen.

Eine bekannte Ladung von sEVs ist microRNA (miRNA), eine Gruppe kleiner, nicht-kodierender RNA-Moleküle mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden, die an die 3'-UTR-Regionen der mRNA binden und die Proteinexpression normalerweise negativ regulieren. miRNAs sind an vielen zellulären Rollen beteiligt und wurden auch mit der Pathogenese verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs und neurodegenerativer Erkrankungen, in Verbindung gebracht. Cheng et al. führten eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalyse von serumabgeleiteten sEV miRNA-Expressionssignaturen von Alzheimer-Patienten^{durch 5}. In Verbindung mit Neuroimaging-Aufzeichnungen und bekannten Risikofaktoren wie Alter, Geschlecht und APOE ε4-Allelpräsentation zeigten die Ergebnisse eine Vorhersage der Alzheimer-Krankheit mit einer Sensitivität von 87 % und einer Spezifität von 77 %. Darüber hinaus hat die Forschung zwei hochregulierte Liquor-miRNAs (miR-151a-3p, let-7f-5p) und 3 herunterregulierte miRNAs (miR-27a-3p, miR-125a-5p und miR-423-5p) identifiziert, die möglicherweise PD⁶ im Frühstadium diagnostizieren können. Bei pathologischen Erkrankungen kann der pathologische Status bestimmten charakteristischen Krankheitssymptomen vorausgehen, während bei der Neurodegeneration die Anhäufung pathologischer Merkmale viel früher erfolgt als der kognitive Verfall.

MicroRNAs sind aufgrund ihrer vielfältigen Funktionen und einer epigenetischen Regulation höherer Ordnung potenziell ein wirksamerer Biomarker als Proteine. Anhand von Hirngewebe können Forscher möglicherweise spezifische vom Gehirn abgeleitete sEV (BDsEV) miRNA-Signaturen für Krankheiten und ihre Subtypen identifizieren. Zum Beispiel können sEVs mit neuronalen und glialen Markern unterschiedliche miRNA-Fracht aufweisen, und die Analyse kann zu präziseren Methoden zur Krankheitserkennung führen. Darüber hinaus wird vermutet, dass BDsEVs eine große Rolle bei der transsynaptischen Ausbreitung neuropathogener Proteine spielen⁷. Frühere Berichte haben Immunpräzipitation und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (Saccharosegradient) vorgeschlagen, um sEVs aus frisch gefrorenem Hirngewebe zu erhalten ^8,9. Diese Ansätze erfordern jedoch eine spezifische Infrastruktur mit Ultrazentrifuge und nachgeschalteten Aufreinigungsmethoden, um qualitativ hochwertige sEV-Proben zu gewinnen¹⁰. In neueren Berichten wurden mehrere Änderungen und Verbesserungen des Ansatzes vorgeschlagen 11,12,13; Trotzdem sind die Isolierung und Untersuchung von sEV-abgeleiteter microRNA aus menschlichen Geweben immer noch nicht weit verbreitet. Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz zielt darauf ab, ein verfeinertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für sEV-Studien aus dem Gehirn bereitzustellen, um den Zugang zu dieser Technik zu verbessern. Wir haben ein Protokoll mit minimalen Mengen an Hirngewebe etabliert, aus dem wir reine sEVs mittels Größenausschlusschromatographie isoliert haben und qualitativ hochwertige Next-Generation-Sequencing-Daten aus der microRNA-Fracht dieser sEVs gezeigt haben.

Protokoll

Die Arbeit wurde von der Manchester Brain Bank (REC-Referenz 09/H0906/52) und von der Ethikkommission der University of Salford (Bewerbungs-ID: 3408) ethisch genehmigt.

1. Abbau der intrazellulären Matrix mittels Kollagenase an gefrorenen Hirngewebeschnitten

1. 250 mg gefrorenes Hirngewebe (ca. 0,4 mm dicke Fragmente) mit einem sterilisierten Skalpell auf einer Kühlplatte in dünne Scheiben schneiden und 2 ml 75 U/ml-Kollagenase Typ-III/Hibernate-E-Lösung hinzufügen.
2. Jede Probe wird 20 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Bei 5 Minuten invertieren Sie jede Probe zweimal, um sie zu mischen; Pipettieren Sie jede Probe nach 10 Minuten dreimal vorsichtig mit einer 10-ml-Einweg-Stripette aus Kunststoff.
3. Legen Sie jede Probe auf Eis und fügen Sie 1x Proteasehemmer-Cocktail und 1x Phosphatase-Hemmer hinzu. Dadurch wird die Enzymreaktion gestoppt und es ist der Endpunkt der Verdauung mittels Kollagenase Typ-III.
4. Jede Hirngewebeprobe wird bei 300x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Jeder Überstand wird aufgefangen und bei 2000 x g 15 min bei 4 °C weiter zentrifugiert.
5. Jeder Überstand wird erneut aufgefangen und durch einen 0,22-μm-Filter filtriert. Jedes Filtrat wird bei 10 000 x g 48 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert.
6. Den Überstand auffangen und Fällungspuffer im Verhältnis 2:1 zu jeder Probe hinzufügen. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
7. Jede Probe wird 96 Minuten lang bei 4 °C bei 10 000 x g zentrifugiert und das Pellet in 100 μl extrazellulärem Vesikel (EV)-freiem PBS resuspendiert.

2. Vorbereitung von Größenausschluss-Chromatographiesäulen

1. Vor der Verwendung die vorbereitete SEC-Säule 15 min lang bei Raumtemperatur (RT) äquilibrieren.
   HINWEIS: Die untere Kappe muss vor dem Schraubverschluss entfernt werden.
2. Entfernen Sie nach der Äquilibrierung den Konservierungsmittelpuffer von der Oberseite der Säule und waschen Sie die Säule zweimal mit 250 μl EV-freiem PBS. Bei jedem PBS-Waschgang gelangt er durch die Schwerkraft in die Säule.

3. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie

1. Geben Sie das resuspendierte Pellet auf die Oberseite der SEC-Säule und zentrifugieren Sie die Säule bei 50 x g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
2. Geben Sie 180 μl EV-freies PBS auf die Oberseite der SEC-Säule und zentrifugieren Sie die Säule 1 Minute lang bei 50 x g , so dass die aus dem Gehirn stammenden sEVs aus der Säule eluieren können.
   HINWEIS: Der oben beschriebene Teil des Protokolls ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

4. Bestätigung kleiner extrazellulärer Vesikelmarker durch Western Blot

1. Um sEVs vor der Western-Blot-Analyse zu lysieren (um sicherzustellen, dass alle Membran- und zytosolischen Ladungen analysiert werden), verdünnen Sie die isolierte sEV-Probe 1:1 in Lyse- und Extraktionspuffer (1x Proteaseinhibitor und 1x Phosphatase-Inhibitor).
2. Die Probe wird 30 Minuten lang bei 4 °C gerührt.
3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14 000 x g für 15 min.
4. Sammeln Sie den Proteinüberstand und messen Sie die Proteinkonzentrationen mit einem Protein-Assay-Kit.
5. Mischen Sie die Proben mit 4x Laemmli-Puffer und laden Sie 20 μg Protein in jede Vertiefung gegen eine vorgefärbte Proteinleiter.
6. Sobald sie aufgelöst sind, übertragen Sie die Proteine auf eine 0,45 μm große Nitrozellulosemembran. Blockieren Sie die Membran nach dem Transfer für 2 h in 5 % BSA.
7. Inkubieren Sie die Membranen über Nacht mit Primärantikörpern (Tabelle 1).
8. Waschen Sie die Membran dreimal mit Waschpuffer (1 % Tween20 in PBS) und färben Sie sie mit einem Anti-Maus-Sekundärantikörper. Danach dreimal mit Waschpuffer (1 % Tween20 in PBS) waschen.
9. Befolgen Sie die obigen Schritte im Manuskript, bevor Sie die Blots abbilden.
10. Bild mit Meerrettichperoxidase (HRP)-Substrat.

5. Nachweis kleiner extrazellulärer Vesikel durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)

1. Führen Sie eine NTA durch, um die Konzentration und Größe aller Partikel in der Probe zu analysieren. Dazu wird jede Probe in PBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1:1000 verdünnt.
2. Injizieren Sie die Probe in das NTA-Gerät und lesen Sie die Probe bei einer Wellenlänge von 550 nm ab. Verwenden Sie zu diesem Zeitpunkt die Partikelmenge, um die Proteinmenge pro Partikel (normalerweise in Femtogramm ausgedrückt) zu messen, wie in den MISEV-Richtlinien empfohlen.
3. Als nächstes verdünnen Sie für fluoreszierendes NTA die orangefarbene Zellmaske (CMO) (färbt alle biologischen Partikel in einer Probe) in PBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1:1000. Daraus wird der CMO-Farbstoff mit einer sEV-Probe mit einem Verdünnungsfaktor von 1:10 verdünnt - Inkubieren Sie diesen Verdünnungsschritt 30 min lang im Dunkeln bei 4 °C.
4. Die zweite GMO-Verdünnung mit PBS um einen Verdünnungsfaktor von 1:1000 verdünnen.
   HINWEIS: Die endgültige Verdünnung des CMO-Farbstoffs muss 1:10 000 000 betragen.
5. Lesen Sie den CMO jeder sEV-Probe bei einer Wellenlänge von 550 nm mit dem NTA-Gerät ab.
6. Für die Tetraspanin-Fluoreszenzantikörper (siehe Materialtabelle) wird zunächst der jeweilige Antikörper in PBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1:10 verdünnt. Daraus verdünnen Sie jeden der Farbstoffe mit einer sEV-Probe um einen Verdünnungsfaktor von 1:10 - Inkubieren Sie den Verdünnungsschritt im Dunkeln für 2 h bei 4 °C.
7. Verdünnen Sie die zweite Antikörperverdünnung mit PBS um einen Verdünnungsfaktor von 1:1000.
   HINWEIS: Die endgültige Verdünnung jedes Tetraspanin-Antikörpers muss 1:100 000 betragen.
8. Lesen Sie die Fluoreszenz-Antikörper-Messwerte der sEV-Probe bei einer Wellenlänge von 550 nm mit dem NTA-Gerät.

6. Nachweis kleiner extrazellulärer Vesikel durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Biomedical Microscopy Facility an der University of Liverpool durchgeführt.

1. Fixieren Sie zunächst sEV-Proben mit Glutaraldehyd und färben Sie sie mit Uranylacetat.
2. Dehydrieren Sie die Probe durch eine abgestufte Reihe von Alkoholen, die für die TEM bereit sind.
3. Nehmen Sie Proben mit einem geeigneten Transmissionselektronenmikroskop ab.

7. Behandlung mit Proteinase K und RNase A

1. Zu 50 μl isolierten aus dem Gehirn gewonnenen EVs wird 1 μl 20 μg/μl Proteinase K hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
2. Stoppen Sie jede Reaktion, indem Sie 1x Proteinase-Inhibitor-Cocktail hinzufügen und 10 Minuten auf Eis inkubieren.
3. Nach der Inkubation 1 μl 10 μg/μl RNase A zu jeder Probe geben und 30 Minuten lang bei 37 °C weiter inkubieren.
   HINWEIS: Fahren Sie sofort mit Abschnitt 8 fort.

8. Vollständige RNA-Isolierung aus kleinen extrazellulären Vesikeln

1. Um die Gesamt-RNA zu isolieren, fügen Sie 700 μl hochwertiges RNA-Rückgewinnungs-Lysereagenz zu 50 μl einer Probe aus dem Gehirn (BDsEV) hinzu. Jede Probe 1 h lang rühren.
2. 140 μl Chloroform zugeben, jede Probe 20 s lang kräftig schütteln und 3 Minuten bei RT inkubieren lassen.
3. Die Probe wird bei 15 min bei 4 °C bei 12 000 x g zentrifugiert und die Interphase aus der Probe entnommen. Fügen Sie 1,5x Volumen 100% Ethanol hinzu.
4. 700 μl Interphase/Ethanol-Gemisch, RNA-Isolationssäulen zugeben und bei ≥8000 x g für 15 s bei RT zentrifugieren.
   HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt mit allen Interphase-/Ethanolproben.
5. Geben Sie 700 μl Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie 15 s lang bei ≥8000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
6. Fügen Sie 500 μl Puffer RPE hinzu und zentrifugieren Sie erneut bei ≥8000 x g für 15 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
7. 500 μl 80%iges Ethanol zugeben und bei ≥8000 x g für 2 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
8. Trocknen Sie zu diesem Zeitpunkt die Säulenmembran, indem Sie die Säulen bei voller Geschwindigkeit (>8000 x g) 5 Minuten lang bei geöffnetem Deckel zentrifugieren.
9. Übertragen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen, geben Sie 14 μl RNase-freies Wasser direkt auf die Säulenmembran und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei ≥8000 x g , um die Gesamt-RNA aus BDsEVs zu eluieren.
10. Quantifizieren Sie die gesamte microRNA mit Proben unter Verwendung eines miRNA-Quantifizierungs-Assay-Kits, bei dem die Proben auf einem Quantifizierungsfluorometer gemessen wurden, wobei der miRNA-Assay-Typ ausgewählt wurde.

9. Sequenzierung kleiner RNAs

1. Nach der Quantifizierung der miRNA in der Probe synthetisieren Sie eine cDNA-Bibliothek mit dem Small RNA-Seq Library Prep Kit.
   HINWEIS: Bei Verwendung dieses Protokolls umfasste die Bibliotheksgenerierung vier Schritte: 3'-Adapterligation, Aufreinigung, 5'-Adapterligation und reverse Transkription - wobei am Ende eine RNA/cDNA-Bibliothek gebildet wird. Nach der Generierung der Bibliothek erfolgt die Endpunkt-PCR-Amplifikation, bei der Indexprimer hinzugefügt werden (die für Multiplexzwecke verwendet werden), wonach die Proben aufgereinigt werden.
2. Um die RNA-Qualität zu testen, verwenden Sie einen Qualitätskontroll-Anwendungsassay, in dem die Größe jedes Präparats und die Spitzenintensität aufgeführt sind.
3. Um die DNA-Konzentration zu testen, messen Sie die DNA-Quantifizierung auf einem Quantifizierungsfluorometer und wählen Sie den dsDNA-Assay-Typ aus.
4. Bereiten Sie die Proben mit dem Reagenzienkit für die Small RNA Seq vor, wonach die Proben in die Durchflusszelle geladen werden.

Ergebnisse

Um das Vorhandensein von BDsEVs zu bestätigen, wurden drei Techniken verwendet: Western Blotting, NTA und TEM (Abbildung 3). Die Western-Blot-Ergebnisse (Abbildung 3A und ergänzende Datei 1) zeigen das Vorhandensein aller fünf positiven Marker (CD9, CD63, CD81, Flot-1 und TSG101) und das Fehlen von Calnexin in sEVs (als Negativkontrolle verwendet), was bestätigt, dass keine Kontamination mit zellulärem Inha...

Diskussion

Dieses modifizierte und verbesserte Protokoll zur Isolierung von kleinen extrazellulären Vesikeln aus dem Gehirn und ihrer microRNA-Fracht demonstriert die Machbarkeit, minimales Gewebe zu verwenden, ohne die Qualität und Quantität der nachgelagerten Produkte zu beeinträchtigen. Im Bereich der Biomarker-Entdeckung kann die Identifizierung molekularer Identifikatoren, die spezifisch für Zell- und Gewebetypen sind, zu leichter zugänglichen Mitteln für nicht-invasive diagnostische T...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094