Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir optimierte Gewebe-Clearing-Protokolle vor, um die murine Aorta in drei Dimensionen (3D) abzubilden. Wir beschreiben modernste Verfahren zur Immunfärbung, optischen Klärung und Bildgebung mit dem Ziel, die anatomische Nähe des peripheren Nervensystems zu atherosklerotischen Plaques und die Adventitia bei Atherosklerose zu definieren.

Zusammenfassung

Neuere Forschungen haben das Verständnis der Atherosklerose als transmurale chronische Entzündungserkrankung vorangetrieben, an der alle drei Schichten der Arterienwand beteiligt sind, einschließlich der Intima-Plaque, der Medien und der Adventitia, die die äußere Bindegewebsschicht der Arterien bildet. Unsere jüngsten Studien deuten darauf hin, dass die Adventitia vom peripheren Nervensystem als Kanal genutzt wird, um alle Gewebezellen zu erreichen. Wir fanden auch heraus, dass das periphere Nervensystem, d.h. das sensorische und sympathische Nervensystem, große Umbauprozesse durchläuft, die die Neogenese von Axonnetzwerken in der Nähe von atherosklerotischen Plaques beinhalten. In diesem Zusammenhang verspricht das Verständnis der Struktur des neuronalen Netzwerks und seiner Wechselwirkungen mit den vaskulären Komponenten erkrankter Arterien ein besseres Verständnis der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Um diese Ziele zu erreichen, sind Methoden erforderlich, um die subzelluläre Architektur der intakten gesunden und erkrankten Arterien zusammen mit ihren umgebenden perivaskulären Kompartimenten sichtbar zu machen. Die Gewebereinigung ermöglicht die intakte Tiefengewebsbildgebung von größeren Gewebekompartimenten, die sonst nicht zugänglich wären. Es ermöglicht die volumetrische Bildgebung intakter Arterien durch die Integration von Markierungs-, Clearing-, fortschrittlichen mikroskopischen Bildgebungs- und Bildverarbeitungswerkzeugen. Hier beschreiben wir zwei unterschiedliche, aber komplementäre passive Gewebe-Clearing-Ansätze, nämlich das wässrige 2,2-Thiodiethanol (TDE)-Clearing und das lösungsmittelbasierte Immunmarkierungs-ermöglichte dreidimensionale Imaging von solvent-cleared organ (iDISCO) Clearing, um isolierte Aortensegmente oder ganze Aorta in-situ in der gesamten Maus abzubilden.

Einleitung

Histologische Techniken vermitteln ein grundlegendes Verständnis biologischer Proben durch das Schneiden von Geweben/Organen. Die Abgrenzung komplexer anatomischer Zell-Zell- und Gewebe-Gewebe-Wechselwirkungen in drei Dimensionen (3D) war jedoch - bis vor kurzem - schwierig zu erreichen. Dieser ungedeckte Bedarf zeigte sich besonders deutlich im Zusammenhang mit dem Herz-Kreislauf-System bei gesunden und kranken Zuständen. Die Bildgebung von intaktem Gewebe war in der Vergangenheit aufgrund der Lichtabsorption und Lichtstreuung eine Herausforderung, wodurch sie von Natur aus undurchsichtig sind. Das Tissue Clearing macht die intakte biologische Probe transparent, indem es diese Einschränkungen minimiert. Jüngste Entwicklungen in der Gewebereinigungstechnik ermöglichen eine hochauflösende 3D-Bildgebung von ungeschnittenen transparenten Geweben, um einen beträchtlichen Einblick in die zelluläre und strukturelle Mikroarchitektur ganzer Organe mit Mikrometerauflösung zu erhalten und so die Definition anatomischer Konnektivitätsnetzwerke zu ermöglichen.

Die Atherosklerose umfasst drei Schichten der Arterienwand, darunter die innere Intimaschicht, die mittlere Medienschicht und die äußere Bindegewebsschicht, die als Adventitia bezeichnet wird. Atherosklerotische Plaques in der inneren Schicht der Arterien sind seit Jahrzehnten ein konventionelles Ziel der Forschung ^1,2. Die Adventitia-Schicht enthält jedoch Blutgefäße, Lymphgefäße und Nervenfasern des peripheren Nervensystems. Darüber hinaus ist die Adventitia mit dem perivaskulären Fettgewebe und den neuronalen Gewebekomponenten, einschließlich der peripheren Nerven und der perivaskulären Ganglien, verbunden ^3,4. Es ist bekannt, dass periphere Nerven die Adventitia als Kanäle nutzen, um entfernte Zielgewebe und sogar Zellen zu erreichen⁵. Unsere jüngsten Studien haben den Fortschritt im Verständnis der vielschichtigen Wechselwirkungen der wichtigsten biologischen Systeme, zu denen das Immunsystem, das Nervensystem und das Herz-Kreislauf-System gehören, vorangetrieben. Wir haben diese Wechselwirkungen als Neuroimmun-Herz-Kreislauf-Schnittstellen bezeichnet ^6,7. Während der Atherogenese werden arterielle Wandkomponenten einer robusten Umstrukturierung und einem Umbau unterzogen. Zum Beispiel bilden sich neben der atherosklerotischen Plaqueprogression in der Intima Immunzellaggregate, und die neuronale Axonneogenese tritt in der murinen Aorta adventitia auf ^6,8,9. Mit fortschreitender Atherosklerose entwickeln sich Immunzellaggregate zu gut strukturierten tertiären lymphatischen Organen (ATLOs) der Arterie mit unterschiedlichen T-Zell-, B-Zell- und Plasmazellbereichen¹⁰. Um diese Veränderungen in 3D abzugrenzen, war die hochauflösende Bildgebung des intakten Gewebes jedoch aufgrund unzureichender Membranpermeabilisierung und inhärenter Lichtstreuung eine Herausforderung¹¹. Tissue-Clearing-Ansätze haben die großen Einschränkungen herkömmlicher histologischer Ansätze überwunden 11,12,13,14,15 mit einer verbesserten Penetration von Antikörpern, um durch gleichmäßige Anpassung des Brechungsindex (RI) tief in intakte Gewebe oder Organe vorzudringen, was zu Bildern mit einer Auflösung im Mikrometerbereich mit höherer Bildgebungstiefe in Voxeln führt. RIs von Proben können entweder mit Glycerin (RI 1,46) oder Immersionsöl (RI 1,52) abgeglichen werden, wodurch Lichtstreuung und sphärische Aberrationen stark reduziert und eine hohe Auflösung ermöglicht werden. Jüngste Fortschritte bei der Reinigung von Ganzorgan- oder Ganzkörpergewebe, wie z. B. wässriges 2,2-Thiodiethanol (TDE) und immunmarkierungsgestützte 3D-Bildgebung von lösungsmittelfreigeschalteten Organen (iDISCO), zusammen mit volumetrischen Bildgebungsverfahren (einschließlich konfokaler, Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie) haben die Rekonstruktion der Mikroanatomie der Gefäßarchitektur ermöglicht, indem sie ihren Konnektivitätsatlas konstruiert^{haben 11,16}. Die Visualisierung dieser zellulären und strukturellen Zusammenhänge in 3D kann neue Erkenntnisse liefern, um bisher unbeantwortete biologische Fragen zu beantworten.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde nach den Richtlinien des lokalen und nationalen Ausschusses für Tierverwendung und -pflege durchgeführt. In der vorliegenden Studie wurden hyperlipidämische männliche Apoe^-/- Mäuse auf C57BL/6J-Hintergrund verwendet, die unter einer Standard-Nagetiernahrung gehalten wurden und während des Alterns spontan Atherosklerose entwickeln.

1. Whole-Mount-Bildgebung der isolierten Aorta und TDE-Clearing

1. Vorbereitung des Gewebes
   1. Bereiten Sie das Anästhetikum mit 150 mg/kg Ketamin und 30 mg/kg Xylazin (siehe Materialtabelle) pro Maus vor. Betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion tief und bestätigen Sie dies durch die fehlende Reaktion auf den Tiefenschmerztest.
      HINWEIS: Die Konzentration und das Volumen der Injektion sind wie folgt: Ketamin 100 mg/ml; Xylazin 20 mg/ml; Injektionsvolumen 50:50 Vol.-% Mischung aus Ketamin und Xylazin bei 3 μL/g.
   2. Legen Sie die Maus auf eine mit chirurgischen Papiertüchern bedeckte Schaumstoffplatte und fixieren Sie Arme und Beine mit Klebeband in Rückenlage. Desinfizieren Sie den Brustkorb mit 75%igem Ethanol (siehe Materialtabelle) und entnehmen Sie Blut über den linken Ventrikel mit einer 1-ml-Einwegspritze, um das Blut für eine bessere Durchblutung zu entfernen.
      HINWEIS: Eine kardiale Blutentnahme mittels Thorakotomie kann ebenfalls verwendet werden.
   3. Machen Sie einen Mittellinienschnitt an der Brust, um das Herz freizulegen, und einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof, um eine transkardiale Perfusion zu ermöglichen. Perfundieren Sie die Maus über den linken Ventrikel für 5 min mit 10 mL 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; siehe Materialtabelle) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 20 mL PBS für 5-10 min, bis das Blut ausgespült ist. Zum Schluss 20 min lang mit 10 mL 4% Paraformaldehyd (PFA) perfundieren.
      HINWEIS: Alle Eingriffe können mit einer peristaltischen Perfusionspumpe mit einem Druck von 100-125 mm Hg bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden. Die Perfusionsnadel wird durch das gleiche Loch in das Mausherz eingeführt wie die Blutentnahme.
   4. Entferne innere Organe, einschließlich Milz, Leber, Lunge sowie Magen-Darm- und Fortpflanzungsorgane, mit chirurgischen Instrumenten. Halten Sie das Herz, die Aorta und die Nieren in situ intakt.
      HINWEIS: Chirurgische Instrumente, die zum Sezieren und Entfernen von Organen verwendet werden, sind eine Präparierschere, eine feine Irisschere, eine Federschere, eine stumpfe Pinzette, eine gebogene Pinzette und eine gebogene feine Pinzette.
   5. Die gesamte Aorta von der aufsteigenden Aorta bis zur Beckenbifurkation wird unter dem Präparierstereomikroskop (30-40-fache Vergrößerung) exponiert. Entfernen Sie vorsichtig den Thymus und das Fettgewebe, ohne die Aorta zu verletzen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Aorta nicht zu durchtrennen. Bei Apoe^-/- Mäusen ist das minimal umgebende perivaskuläre Fettgewebe der Aorta für eine zusammenhängende Struktur aufzubewahren.
   6. Ernten Sie die gesamte Aorta in eine Petrischale, die mit PBS gefüllt ist. Teilen Sie die Aorta in verschiedene Segmente und teilen Sie die gesamte Aorta in Längsrichtung mit einer Iris oder einer Federschere, um die Intimaoberfläche freizulegen, und zwar in der Reihenfolge und Richtung, die in Abbildung 1A für die TDE-Reinigung angegeben ist.
   7. Stecken Sie die vordere Aorta in Y-Form auf die flache schwarze Wachsplatte, wie in Abbildung 1A gezeigt. Postfixieren Sie es in 4 % PFA über Nacht bei 4 °C.
      HINWEIS: Stecken Sie die Aorta vor der Fixierung an die Wachsplatte, um ein Falten und Kräuseln in den folgenden Schritten zu vermeiden.
   8. Löse die Aorta und übertrage sie in PBS. Waschen Sie die Aorta 5 Mal lang 5 Minuten lang gründlich.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Aorta zum Waschen jedes Mal in verschiedene Röhrchen, die mit PBS gefüllt sind.
2. Antikörperfärbung für die Aorta en-face
   HINWEIS: Alle Inkubationsschritte werden in 2-ml-Safe-Lock-Röhrchen mit sanfter Drehung oder Schütteln bei RT durchgeführt.
   1. Übertragen Sie die fixierte Aorta für 2 h in eine Blockierungslösung zur Blockierung und Permeabilisierung.
      HINWEIS: Die Blockierungslösung variiert je nach Primär- und Sekundärantikörper. Zum Beispiel Blockierungslösung: 0,5 mg/ml CD16/32 (1:100), 10% normales Eselserum, 2% Triton X-100 in PBS (siehe Materialtabelle)
   2. Inkubieren Sie die Aorta mit Primärantikörpern in der oben genannten Blockierungslösung (Schritt 1.2.1), z. B. CD3e (1:100 Verdünnung), NF200 (1:200 Verdünnung) und B220 (1:200 Verdünnung) für 24 Stunden (siehe Materialtabelle). Waschen Sie die Aorta 5 Mal 5 Minuten lang in PBS.
   3. Inkubieren Sie die Aorta mit Sekundärantikörpern in 10 % normalem Eselsserum (1:300 Verdünnung) und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1 mg/ml) für die Kernfärbung über Nacht (siehe Materialtabelle). Waschen Sie die Aorta 5 Mal 5 Minuten lang in PBS und lagern Sie die Aorta in PBS bei 4 °C bis zum Gewebereinigungsverfahren.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Aorta zum Waschen jedes Mal in verschiedene Röhrchen, die mit PBS gefüllt sind. Decken Sie die Tuben mit Alufolie ab, um sie für Schritt 1.2.3 im Dunkeln zu halten.
3. TDE-Gewebereinigung
   HINWEIS: Alle Inkubationsschritte werden in 2-ml-Safe-Lock-Röhrchen durchgeführt, die sich sanft bei RT drehen und im Dunkeln mit Aluminiumfolie abgedeckt werden. TDE-Arbeitslösungen (siehe Materialtabelle) sind hochpermeabel und sollten vorsichtig in einem Abzug gehandhabt werden. Sammeln und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.
   1. Die gefärbte Aorta in 20%ige TDE-Arbeitslösungen überführen und 1 h inkubieren.
   2. Die Aorta in 47%ige TDE-Arbeitslösungen überführen und 12 Stunden inkubieren. Übertragen Sie die Aorta in 60%ige TDE-Arbeitslösungen und inkubieren Sie sie 24-36 Stunden lang, bis die Proben im sichtbaren Licht transparent werden, um der RI zu entsprechen.
   3. Lagern Sie die Aorta in 60 % TDE bei RT im Dunkeln bis zur Bildgebung.
      HINWEIS: Aktualisieren Sie die Arbeitslösungen alle 30 Minuten für die kurze Inkubationsdauer (z. B. Schritt 1.3.1) und alle 4 Stunden für die langfristige Inkubation (z. B. Schritt 1.3.2). Die Inkubationszeit für jeden Schritt kann je nach Gewebegröße angepasst werden, um eine bessere Antikörperpenetration oder Reinigungstransparenz zu erzielen. Bei ^Apoe-/- Maus-Aorta, die von Fettgewebe umgeben sind, sollte die Inkubationszeit entsprechend verlängert werden.
4. Bildgebung der TDE-reinigenden Aorta mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)
   1. Verwenden Sie handelsübliche doppelseitige, klebrige, rechteckige Abstandshalter-Wells mit einer Dicke von 0,2 mm (siehe Materialtabelle). Kleben Sie die Vertiefung auf einen sauberen Objektträger und übertragen Sie die gereinigte Aorta. Achten Sie darauf, dass die Aorten-Adventitia en face dem Deckglas zugewandt ist.
      HINWEIS: Klopfen Sie die Aorta mit der abluminalen Seite der Aorta mit einer abgewinkelten Pinzette vorsichtig flach mit der abluminalen Seite der Aorta auf die Oberseite. Stapeln Sie bei Bedarf mehrere Imaging-Spacer-Wells, um sie an die Gewebegröße anzupassen.
   2. Montieren Sie die Aorta mit Tropfen 60%iger TDE-Lösung. Befestigen Sie vorsichtig ein Deckglas an der Vertiefung und vermeiden Sie dabei Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas.
      HINWEIS: Entfernen Sie vorsichtig die Blasen mit einer Nadel vor dem Deckglas. Verwenden Sie nicht zu viel Einbettlösung, da die Probe herumschwimmen kann.
   3. Verwenden Sie ein invertiertes CLSM-Gerät (siehe Materialtabelle), das mit einem 20-fach Immersionsobjektiv (NA: 0,75) ausgestattet ist.
      HINWEIS: CLSM ermöglicht volumetrische Bildgebung bis zu einer Tiefe von 70 μm mit einer höheren Auflösung, die für die Analyse des Nervendurchmessers und der Nerven-Immunzell-Interaktion in der Aortenadventitia benötigt wird.
   4. Wählen Sie das 20x/0,75 Immersionsobjektiv (Öl). Stimmen Sie die Hybrid-Diodendetektoren auf Basis der gefärbten Farbstoffe ab. Passen Sie die Anzeigeeinstellungen an und wählen Sie für die Bildgebung das XY-Format mit 1024 x 1024 Pixel.
      HINWEIS: Ein Öl-Immersionsobjektiv erfasst Signale besser als Wasser.
   5. Immersionsöl (mit Glycerin) gleichmäßig entlang der Aorta auf das Deckglas tropfen. Bewegen Sie das 63x-Objektiv grob in Richtung der Probe, bis es das Immersionsöl/Deckglas berührt.
   6. Bewegen Sie das 63x-Objektiv fein unter das Mikroskop, um den interessierenden Bereich zu lokalisieren. Erfassen Sie den Z-Stack von der Adventitia-Seite der Aorta en face in Schritten von 2-4 μm bis zu einer Tiefe von 60 μm für die 3D-Bildgebung.
   7. Benennen Sie die Datei mit Beispieldetails, Scandetails, und speichern Sie die Daten.
5. Bildgebung der TDE-reinigenden Aorta mit einem Multiphotonenmikroskop
   1. Befolgen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.2, um die Aorta en face auf dem Objektträger zu montieren.
   2. Verwenden Sie ein aufrechtes Multiphotonenmikroskop (siehe Materialtabelle), das mit einem 20-fach-Objektiv (Wasserimmersion, NA: 1,00, Arbeitsabstand = 2 mm) ausgestattet ist und volumetrische Bildgebung bis zu einer Tiefe von 1,5 mm ermöglicht.
   3. Erfassen Sie Z-Stacks von der abluminalen Seite in Schritten von 10-15 μm bis zu einer Tiefe von 700 μm. Benennen Sie die Datei und speichern Sie die Daten wie in Schritt 1.4.7 beschrieben.

2. Ganzkörper-Immunfärbung und iDISCO-Gewebereinigung

1. Vorbereitung des Gewebes
   1. Befolgen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.3 oben für die Anästhesie, das Fixieren der Maus und die Perfusion.
   2. Entfernen Sie die Haut und die inneren Organe, einschließlich Milz, Leber, Lunge sowie Magen-Darm- und Fortpflanzungsorgane, mit chirurgischen Instrumenten. Halten Sie das Herz, die Aorta und die Nieren in situ intakt.
   3. Präparieren Sie den Körperteil oberhalb des Zwerchfells und fixieren Sie den unteren Körperteil mit 4% PFA für 1-2 Tage (e) bei 4 °C.
      HINWEIS: Führen Sie die Fixierung, das Waschen und die Inkubation in 50-ml-Röhrchen auf einem sanft rotierenden Schüttler durch. Frischen Sie die Lösung in neuen Tuben 2-3 Mal auf.
   4. Waschen Sie die Probe 10 Minuten lang 3 Mal gründlich bei RT.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Aorta jedes Mal in verschiedene Röhrchen, die mit PBS gefüllt sind.
   5. Inkubieren Sie die Probe in 20 % klaren, ungehinderten Cocktails für die Bildgebung von Gehirn und Körper (CUBIC) für 48 Stunden zur Entfärbung.
      HINWEIS: Für eine 20%ige CUBIC-Lösung lösen Sie 25 g Harnstoff in 15 mL Triton X-100 und 28 mL Quadrol und fügen Sie PBS zum Endvolumen von 100 mL hinzu. Bereiten Sie es in der Haube zu, da die Inhaltsstoffe anregend sind (siehe Materialtabelle).
   6. Waschen Sie die Probe 1 h lang fünfmal gründlich in PBS bei RT.
2. Färbung von Antikörpern
   HINWEIS: Alle Inkubationsschritte werden in 50-ml-Safe-Lock-Röhrchen mit sanfter Drehung oder Schütteln bei 4 °C durchgeführt.
   1. Inkubieren Sie die Probe über Nacht in PBS-Gelatine-Triton X-100-Serum (PGST)-Lösung zur Permeabilisierung und Blockierung.
      HINWEIS: Die Blockierungslösung variiert je nach Antikörper. Zum Beispiel Blockierungslösung: PBS-Gelatine-Triton X-100-Serum (PGST, siehe Materialtabelle) Lösung: 0,2 % Schweinehautgelatine, 0,5 % Triton X-100 und 5 % Ziegenserum in PBS.
   2. Inkubieren Sie die Probe mit Primärantikörpern in PGST-Lösung, z. B. NF200 (1:200 Verdünnung, siehe Materialtabelle) bei 4 °C und schütteln Sie sie 10-12 Tage lang. Waschen Sie dann die Probe gründlich 1 h 5 Mal bei RT in PGST.
   3. Die Probe wird 7 Tage lang mit einer Sekundärantikörperlösung (1:300 Verdünnung) und DAPI (1 mg/ml) in PGST bei 4 °C inkubiert.
   4. Waschen Sie die Probe gründlich 1 h 5 Mal bei RT in PGST. Übertragen Sie die Probe in PBS und lagern Sie die Aorta in PBS bei 4 °C für weitere Schritte.
      HINWEIS: Decken Sie die Tuben mit Aluminiumfolie ab, um sie für die Schritte 2.2.3-2.2.4 dunkel zu halten.
3. Modifiziertes iDISCO Gewebe-Clearing
   HINWEIS: Während des Reinigens sollten die Röhrchen mit Aluminiumfolie abgedeckt werden, um ein Signalbleichen/Abschrecken durch direkte natürliche/künstliche Lichteinwirkung zu vermeiden. Alle organischen Reagenzien, die bei der DISCO-Räumung verwendet werden, sind schädlich, und alle Reinigungsschritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Tragen Sie einen Laborkittel, Handschuhe und eine Maske, wenn Sie mit den Reagenzien umgehen, um ein Einatmen und den Kontakt mit Haut und Augen zu vermeiden. Sammeln Sie den Räumabfall und entleeren Sie ihn in entsprechende Abfallbehälter in der Haube.
   1. Die gefärbten Proben aus Schritt 2.2.4 werden in eine Reihe erhöhter Konzentrationen von Tetrahydrofuran (THF) Arbeitslösungen zur Dehydratisierung überführt, d. h. 50 %, 70 %, 90 % und 100 % (zweimal 100 %). 12 Stunden pro Konzentration inkubieren.
      HINWEIS: Verdünnen Sie das THF-Reagenz (99%-100%) in destilliertem Wasser für Arbeitslösungen unterschiedlicher Konzentrationen in der Haube. Aktualisieren Sie die Arbeitslösungen alle 6 Stunden.
   2. Die Probe wird für 3 Stunden in eine Lösung aus absolutem Dichlormethan (DCM, siehe Materialtabelle) zur Lipidentfernung überführt.
   3. Die Probe wird in eine RI-passende Benzylalkohol-Benzylbenzoat-Arbeitslösung (BABB) überführt (siehe Materialtabelle). 3-6 h inkubieren, bis das Gewebe durchscheinend und im sichtbaren Licht weitgehend transparent ist.
      HINWEIS: Zur Herstellung der BABB-Arbeitslösung 1 Teil Benzylalkohol und 2 Teile Benzylbenzoat (1:2) in einer Glasflasche mischen. Schütteln Sie es vorsichtig 5 Minuten lang in der Haube.
4. Bildgebung von iDISCO bei der Reinigung von Gewebe mit einem Lichtblattmikroskop
   HINWEIS: Bilde die geklärte Probe ab, sobald eine optimale Transparenz erreicht ist. Für die Bildgebung wird ein Lichtblattmikroskop, wie z.B. ein Ultramikroskop-II (siehe Materialtabelle), verwendet. Füllen Sie das bildgebende Reservoir mit der endgültigen Reinigungslösung, der BABB-Lösung. Achten Sie darauf, kein BABB auf das Instrument zu verschütten, um Schäden am Instrument zu vermeiden.
   1. Verwenden Sie ein 1-fach-Luftobjektiv für Bilder mit geringer Vergrößerung, die die gesamte Breite der gesamten Probe abdecken. Die Probe aus der Reinigungslösung vorsichtig auf ein Papiertuch übertragen und kurz trocknen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um ein Zusammendrücken der Probe zu vermeiden.
   2. Wählen Sie einen Probenhalter in geeigneter Größe basierend auf der Proben-/Gewebegröße aus und befestigen Sie die Rückseite der Probe mit Sekundenkleber am Probenhalter.
      HINWEIS: Warten Sie 1-2 Minuten, bis die Probe fest mit dem Probenhalter verbunden ist.
   3. Füllen Sie das Bildgebungsreservoir des Lichtblattmikroskops mit BABB-Lösung und legen Sie die Probe vorsichtig hinein. Stellen Sie den Probenhalter so ein, dass die Probe senkrecht zum Lichtblatt steht und richtig beleuchtet ist.
   4. Senken Sie das Objektiv, um die Probe zu fokussieren, und passen Sie die Anzeigeeinstellungen an, während Sie fokussieren, um die Probe richtig anzuzeigen. Wählen Sie die richtigen Lichtblätter in der Mikroskopsoftware aus und passen Sie ihre Breite an, um das gesamte Sichtfeld gleichmäßig auszuleuchten.
      HINWEIS: Bei einem Ultramikroskopsystem mit beidseitiger Laserbeleuchtung beginnen Sie damit, den Laser auf einer Seite auszurichten und zu fokussieren. Sobald beide Seiten eingestellt sind, aktivieren Sie beide Seitenlaser, um ein zusammengeführtes Scanbild von beiden Beleuchtungen zu beobachten.
   5. Wählen Sie einen dunkelroten Kanal (680 nm), um NF200-gefärbte neuronale Strukturen abzubilden, und einen Autofluoreszenzkanal (488 nm), um ungefärbte Aorta und Bindegewebe abzubilden. Passen Sie die Laserleistung in Abhängigkeit von der Intensität des Fluoreszenzsignals an, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis, die Belichtungszeit und die Breite der Lichtblätter zu erzielen.
   6. Wählen Sie den X-Y-Z-Scan-Modus. Stellen Sie den Z-Stapel-Scan auf einen Z-Schritt von 2-8 μm ein und wählen Sie eine Überlappung von 25 % bis 60 % entlang der Längs-Y-Achse der Kachelscans (16 Bit), die die ventralen und dorsalen Oberflächen der Proben abdeckt, um das gesamte Probenvolumen (bis zu einer Tiefe von 6-8 mm) abzubilden.
   7. Benennen Sie den Scan mit detaillierten Informationen, einschließlich des Scandatums, des Probennamens, des verwendeten Antikörpers, des Objektivs, des Zoomfaktors, der Z-Schritte und der verwendeten Laser. Speichern Sie die Daten.
   8. Wechseln Sie über die Zoom-In-Funktion zu einer höheren Vergrößerung (2x oder 4x), um bestimmte Körperregionen von Interesse abzubilden.
   9. Führen Sie die Schritte 2.4.4-2.4.7 oben aus, um ein Imaging durchzuführen und die Daten zu speichern.

3. Bildverarbeitung und Analysen

HINWEIS: Für die Verarbeitung wird eine Hochleistungs-Verarbeitungs-Workstation benötigt. Stellen Sie die Datensicherung sofort nach der Verarbeitung aufgrund des hohen Imaging-Volumens (5-100 GB pro Image) sicher.

1. Bildverarbeitung von CLSM- und Multiphotonenbildern
   1. Laden Sie die gekachelten Z-Stapel-Bilder von CLSM- und Multiphotonenmikroskopen in die Bildverarbeitungs-Workstation, die mit Las X, Imaris (Bildanalysesoftware) oder Fiji-Software für 3D- und zweidimensionale (2D) Visualisierung, Segmentierung und Quantifizierung ausgestattet ist.
   2. Um die Volumentiefe einer Zelle oder Struktur farblich zu kodieren, verwenden Sie eine Bildwiederherstellungssoftware (siehe Materialtabelle), um das Rohbild zu dekonvolutieren und eine Projektion mit maximaler Intensität der entfalteten Daten unter Verwendung der zeitlichen Farbcodierung in Las X oder Fidschi zu erzeugen.
2. Bildverarbeitung von Lightsheet-Bildern
   1. Laden Sie die gekachelte TIFF-Bildserie mit Z-Stapel in die Fidschi-Software. Fügen Sie Bilder mit dem Stitching-Plugin von Fidschi zusammen und speichern Sie zusammengefügte Bilder im TIFF-Format.
      HINWEIS: Komprimieren Sie bei Bedarf die zusammengefügten Bilder im LZW-Format, um eine schnelle Verarbeitung mit anderer Software zu ermöglichen.
   2. Laden Sie die zusammengefügten Bilder in eine 3D-Visualisierungssoftware (siehe Materialtabelle), um die Bilder zu segmentieren. Verfolgen Sie manuell die neuronalen und vaskulären Strukturen in der x-y-z-Achse. Für die manuelle Verfolgung kleiner Nervenfasern wählen Sie die NF200⁺ -Signale Pixel für Pixel in jeder Z-Ebene entlang des gesamten Weges der Nervenfaser zwischen Aorta und Ganglien manuell aus.
   3. Laden Sie vorverarbeitete Bilder in eine Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle), um Videos zu generieren und die Bilder in 2D und 3D zu visualisieren.
   4. Verwenden Sie die Autofluoreszenz, um die Aorta und das Bindegewebe, einschließlich Lymphknoten und Muskeln, in der Bildanalysesoftware zu segmentieren. Wenden Sie separate Pseudofarben in der Bildanalysesoftware an, um unterschiedliche Aortensegmente wie Aortenwand und Plaque zu visualisieren.
   5. Verwenden Sie die CLAHE-Funktion (Contrast-Limited Adaptive Histogram Equalization) in der Fidschi-Software, um den lokalen Kontrast über dem Hintergrund der verarbeiteten Bilder zu verbessern.

Ergebnisse

Um die Mikroanatomie der intakten gesunden und kranken Aorta zu demonstrieren und die physikalischen Verbindungen zwischen dem Immunsystem, dem Nervensystem und dem Herz-Kreislauf-System in Mausmodellen der Atherosklerose aufzudecken, verwendeten wir zwei komplementäre Gewebe-Clearing-Ansätze: TDE-Clearing der isolierten Aorta und iDISCO-Clearing der gesamten Maus (Abbildung 1). Nach der Immunfärbung des gesamten Mount wurde die Aorta mit einer R...

Diskussion

Atherosklerose kann als transmurale entzündliche Erkrankung der Arterien angesehen werden, an der alle drei Schichten der Arterienwand beteiligt sind. Darüber hinaus sind die Arterien vom perivaskulären Fettgewebe und dem neuronalen Gewebe umgeben. Während des Fortschreitens der Atherosklerose erfährt jedes dieser Gewebe erhebliche zelluläre und strukturelle Veränderungen, die Methoden erfordern, um einen subzellulären optischen Zugang zu den intakten Geweben zu erhalten, die ges...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic