Formulierung von Nanomaterialien auf Zinkbasis unter Verwendung des Eucommia ulmoides Rindenextrakts und ihres Wundheilungspotenzials

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Synthese von Zinkoxid (ZnO)-Nanopartikeln unter Verwendung des polyisoprenreichen wässrigen Extrakts vor, der aus der Rinde von Eucommia ulmoides gewonnen wird. Das Wundheilungspotenzial der synthetisierten ZnO-Nanopartikel auf humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurde mit Hilfe des Scratch-Assays, einer einfachen, kostengünstigen und effizienten Methode, bewertet.

Zusammenfassung

Der wässrige Extrakt aus der Rinde von Eucommia ulmoides dient als reichhaltige Quelle für bioaktive Verbindungen mit zahlreichen gesundheitlichen Vorteilen. Das Protokoll zielt darauf ab, die Herstellung von Zinkoxid (ZnO)-Nanopartikeln unter Verwendung des Eucommia-Ulmoides-Rinden-vermittelten polyisoprenreichen wässrigen Extrakts zu untersuchen. In der Zwischenzeit ist das vorgeschlagene Protokoll mit der Vorbereitung von Wundheilungsmaterial verbunden, indem es den Prozess erleichtert. Darüber hinaus wurde das Wundheilungspotenzial der synthetisierten Nanopartikel (Eu-ZnO-NPs) mit Hilfe eines einfachen Scratch-Assays auf einer Monoschicht einer humanen Nabelvenen-Endothelzelle (HUVEC) bewertet. Nach 24 Stunden Behandlung mit Eu-ZnO-NPs wurden die Zellproliferation und Migration von HUVEC-Zellen untersucht. Am Ende der Studie wurde eine Zellproliferation und -migration in zerkratzten Monolayern beobachtet, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Eu-ZnO-NPs behandelt wurden, während in Kontrollzellen schlechte Zellmigrations- und Proliferationsraten beobachtet wurden. Von den gewählten Konzentrationen zeigten 20 μg/mL Eu-ZnO-Nanomaterialien eine bessere Zellmigration und ein erhöhtes Wundheilungspotenzial.

Einleitung

Es hat sich gezeigt, dass Heilpflanzen und pflanzliche Verbindungen zahlreiche gesundheitliche Vorteile aufweisen¹. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtete, dass 80 % der Weltbevölkerung für die primäre Gesundheitsversorgung auf traditionelle Heilpflanzen angewiesen sind. China ist bekannt und beliebt für seine Praktiken der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM). Es wurde berichtet, dass chinesische Heilkräuter verschiedene Krankheiten behandeln und wegen ihres biologischen Potenzials eingesetzt werden. Heilpflanzen dienen als Reservoir für bioaktive Verbindungen und spielen vielfältige therapeutische Rollen. Auch Heilpflanzen wurden zur Behandlung der Wunden eingesetzt. Es gibt verschiedene Arten von Ansätzen, die zur Behandlung chronischer Wunden angewendet werden². Eine kürzlich durchgeführte Untersuchung ergab, dass Heilpflanzen am Wundheilungsprozess beteiligt sind, indem sie günstige Bedingungen für die Heilung bieten, frei von Infektionen, und die Geweberegeneration fördern³. In der Zwischenzeit können die antibakteriellen und antimykotischen Eigenschaften der bioaktiven Verbindungen, die in Heilpflanzen enthalten sind, dazu beitragen, Wunden zu heilen und die Wundheilungseffizienz zu beschleunigen⁴.

Metallbasierte Nanomaterialien gewinnen aufgrund ihrer biokompatiblen und biologisch abbaubaren Eigenschaften zunehmend an Aufmerksamkeit. Eucommia ulmoides, allgemein als chinesischer Kautschukbaum bezeichnet, ist eine in China heimische Art. Die Blätter und die Rinde des Baumes werden in medizinischen Praktiken verwendet. Am wichtigsten ist, dass die Pflanzenart in den zentralen und westlichen Provinzen Chinas angebaut wurde⁵. Peng et ^al.6berichteten, dass Blätter, Rinden und staminate Blüten essbar waren und therapeutisches Potenzial hatten. Darüber hinaus sind E. ulmoides die beste Quelle für Lignane, Phenylpropanoide, Iridoide, Flavonoide, Aminosäuren und Spurenelemente. Darüber hinaus wurde die Rinde für verschiedene biomedizinische Anwendungen verwendet, z. B. zur Kontrolle des Blutdrucks, zur Fettsenkung und zur Förderung von Antiosteroporose und hypoglykämischer Aktivität⁷. Daher ist es zweifellos erwiesen, dass der Rindenextrakt von E. ulmoides eine lange Geschichte in der traditionellen chinesischen Medizin hat. Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass das natürliche Polymer Polyisopren reich an den Rinden, die Eucommia ulmoides⁸ enthält. Basierend auf den obigen Informationen zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, Nanomaterialien unter Verwendung von Eucommia ulmoides-Rindenextrakten herzustellen. Die Kombination von Zink mit Rindenextrakt ist eine attraktive Wahl für die Herstellung von Nanomaterialien. Insgesamt bestand das Ziel der vorliegenden Untersuchung darin, ein neuartiges hybrides Nanomaterial für Anwendungen zur Wundheilung herzustellen.

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Protokoll

HINWEIS: Vor der Herstellung des Extrakts wurde das erhaltene Rindenmaterial zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und an einem schattigen Ort getrocknet. Die im Schatten getrockneten Rinden wurden in einem luftdichten Behälter gelagert.

1. Zubereitung von Eucommia ulmoides Rindenextrakt

1. Die Rinde des Eucommia ulmoides-Baumes mit einer Schere in kleine Stücke schneiden.
2. Waschen Sie das gehackte Rindenmaterial zweimal mit doppelt destilliertem Wasser.
3. Trocknen Sie die Rindenstücke unter 37 °C für 24 h im Schatten.
   1. Passen Sie die Dauer des Trocknungsprozesses basierend auf der für die Studie verwendeten Rindenmenge an. Stellen Sie sicher, dass die Rinde vollständig getrocknet ist, bevor Sie die Rinde in kleine Stücke schneiden. Vermeiden Sie direkte Sonneneinstrahlung.
4. 20 g im Schatten getrocknete Rinde werden in einen Erlenmeyerkolben mit 220 ml sterilem doppeldestilliertem Wasser gegeben und 20 Minuten lang auf 130 °C erhitzt.
   1. Die Farbe der Reaktionslösung wechselt zu hellgelb. Die Farbveränderungen der Lösung treten nach 10 Minuten auf. Lassen Sie die Lösung weitere 10 Minuten erhitzen. Passen Sie das Volumen des doppelt destillierten Wassers basierend auf der Probenmenge an.
5. Lagern Sie den Rohextrakt, der Polyisopren enthält, bei 4 °C zur weiteren Verwendung. Die Bildung einer fadenförmigen Struktur weist auf das Vorhandensein von Polyisopren in den Extrakten hin.

2. Biosynthese von E. ulmoides-Rinden-vermittelten ZnO-Nanopartikeln

1. 1 M Zinknitrat-Dihydrat Zn (NO₃)₂ zu 50 ml entionisiertem Wasser wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Rühren Sie kontinuierlich unter Magnetrührung (60 U/min). Es dauert 30 Minuten, bis sich das Zn (NO₃)₂ vollständig aufgelöst hat.
2. 15 ml E . ulmoides-Rindenextrakt tropfenweise zu 20 ml 1 M Zinknitrat-Dihydrat-Lösung (Zn (NO₃)₂) geben.
3. Das abgedeckte Reaktionsgemisch auf einen Magnetrührer geben, den Rührer einschalten und 3 h lang bei (60 U/min) drehen.
4. Geben Sie 1 N Natriumhydroxid NaOH (3 mL) Lösung tropfenweise in das Reaktionsgemisch, um den pH-Wert auf 9 einzustellen. Fügen Sie NaOH hinzu, bis die Lösungsmischung milchig weiß wird und der pH-Wert nicht mehr als 9 beträgt. Die Lösung erhält eine milchig-weiße Farbe, wenn ZnO-Nanopartikel gebildet werden.
   1. Die Herstellung von 1 M Volumen an Zinknitratdihydrat Zn (_{NO 3})₂ ) kann je nach experimentellem Bedarf variieren. Achten Sie darauf, die frisch zubereiteten Rindenextrakte zu verwenden. Wenn der pH-Wert 10 überschreitet, führt dies zu einer Aggregation von Nanopartikeln.
5. Die synthetisierten Eu-ZnO-NPs werden in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen überführt und bei 100 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   HINWEIS: Die Verunreinigungen können durch sofortiges Waschen vermieden werden.
6. Die gewaschenen Eu-ZnO-NPs in einer Glasplatte auffangen und bei 45-50 °C für 1 h im Heißluftofen trocknen.
   HINWEIS: Wenn die Eu-ZnO-NP länger als 30 Minuten aufbewahrt werden, kann dies die physikalisch-chemische Natur der Nanopartikel beeinträchtigen.

3. Größenbestätigung mittels TEM

1. Bereiten Sie 1 mg/ml Nanopartikel in DDH₂O vor und laden Sie 5 μl Eu-ZnO-NP-Probe in das Kupfergitter und warten Sie, bis es vollständig getrocknet ist. Vortexen Sie die Probe, bevor sie auf das Kupfergitter geladen wird.
2. Laden Sie das Kupfergitter mit Eu-ZnO-NPs auf den TEM-Probenhalter und nehmen Sie Bilder mit 50- und 100-facher Vergrößerung auf.
   HINWEIS: Die Gitter müssen während dieses Schritts mit einer Pinzette aufgenommen werden.

4. Bewertung der Zytotoxizität

1. 1 × 10⁴ HUVECs in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte aussäen und in einen 5 % CO₂ 37 °C-Inkubator geben.
2. Geben Sie 10 μl verschiedener Konzentrationen von 0, 10, 20, 30, 40 und 50 μg/ml Eu-ZnO-NP in die 90% konfluenten Zellen und inkubieren Sie sie für 24 Stunden.
3. Nach der Inkubation das alte Medium entfernen, ohne die Zellen zu stören, 10 μl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung mit 90 μl frischem DMEM-Medium geben und in einem 5 % CO_{2 -}Inkubator mit 37 °C inkubieren.
4. Messen Sie die Absorption von Zellen, die mit CCK8-Lösung bei 450 nm behandelt wurden, mit einem Spektralphotometer.
   HINWEIS: Die Extinktion wurde sofort innerhalb von 15 min gemessen, um Änderungen der Extinktion zu vermeiden.

5. Vorbereitung von HUVEC-Zellen für den Scratch-Assay

1. Eine geeignete Menge (1 × 10⁵) HUVECs in 12-Well-Kulturplatten, die das modifizierte Eagle-Medium von Dulbecco enthalten, mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Pen-Streptokokken aussäen und in einem 5 % CO₂ 37 °C-Inkubator inkubieren.
   1. Bevor Sie den Scratch-Assay durchführen, überprüfen Sie die Konfluenz mit dem inversen Mikroskop.
      HINWEIS: Für die Durchführung des Scratch-Assays werden je nach Bedarf 6-Well-Platten oder 12 Platten verwendet, und die Zelldichte variiert je nach Kulturplatte. Die Verwendung von 70%-80% konfluenten Zellen ist ideal und wird für Scratch-Assays empfohlen. Das Volumen des DMEM-Mediums kann je nach den in der Studie verwendeten Kulturplatten variieren. Zum Beispiel benötigen 6-Well-Platten 1-1,5 mL Kulturmedium und 12-Well-Platten 0,5-1,0 mL Wachstumsmedium.
2. Kratzen Sie vorsichtig mit einer sterilen 200 μl Pipettenspitze in die repräsentative Wunde mit einer Wundbreite von 200 μm.
3. Stellen Sie sicher, dass die Spitze, mit der Kratzer auf der Zellmonoschicht gemacht werden, die Oberfläche der Zellen berührt.
   HINWEIS: Jedes Mal, wenn ein Kratzer entsteht, verwenden Sie die sterile Spitze.
4. Entfernen Sie das gesamte Medium und waschen Sie die HUVEC-Monoschicht mit 1 mL 1x PBS, um die abgelösten Zellen zu entfernen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die abgelösten Monolayer-Zellen vollständig aus den jeweiligen Wells entfernt wurden. Vergewissern Sie sich, dass in dem durch die Wunde entstandenen Bereich keine Schäden aufgetreten sind.
5. Um das Wundheilungspotenzial synthetisierter Eu-ZnO-NPs zu bewerten, geben Sie 0 (Kontrolle), 10 und 20 μg/ml-Konzentrationen von Eu-ZnO-Nanopartikeln in Kombination mit einem vollständigen Medium mit 10 % FBS in die Vertiefungen. Halten Sie die Versuchsplatten bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator.
   HINWEIS: Stören Sie die Zellmonoschicht nicht, während Sie das frische, vollständige Medium hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Monolayer-Zellen während der Inkubation ungestört bleiben.
6. Nehmen Sie Mikrofotos in 0 h und 24 h mit einem inversen Mikroskop auf. Verwenden Sie das Anmerkungswerkzeug, um den Wundverschluss in verschiedenen Zeitintervallen zu messen.
   1. Berechnen Sie den prozentualen Anteil des Wundverschlusses mit der folgenden Formel: Wundverschluss (%) = [(Zellmigration (in μm) nach 0 h - Zellmigration (in μm) nach 24 h)/ Zellmigration (in μm) nach 0 h] x 100.

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Ergebnisse

Ziel der vorliegenden Untersuchung ist es, Nanopartikel aus den Rinden, des Eucommia-ulmoides-Baumes , zu synthetisieren. Das Rindenmaterial wurde in einer schattigen Umgebung vollständig getrocknet (Abbildung 1). Die Rindenmaterialien wurden zur Herstellung des wässrigen Heißwasser-Rohextrakts verwendet, indem die Proben 20 Minuten lang auf 130 °C erhitzt wurden. Eine geringfügige Änderung der Temperatur und der Dauer kann die Phytoverbindung...

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Diskussion

Es wird angenommen, dass die Rinde, der Samen und die Blätter von E. ulmoides zahlreiche gesundheitliche Vorteile aufweisen. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass die Synthese von EU-ZnO-Nanopartikeln mit einem einfachen und kostengünstigen Ansatz erreicht wurde. Der wässrige Extrakt wurde zur Synthese der Nanopartikel verwendet. Das Erhitzen des Rindenmaterials bei hohen Temperaturen kann zum Abbau einiger Phytobestandteile führen und die Extraktionseffizienz verringern. Di...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis