Primäres Sjögren-Syndrom im Zusammenhang mit Lungenadenokarzinom: Untersuchung der potenziellen gemeinsamen pathogenen Mechanismen und experimentelle Verifizierung

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt die operativen Verfahren und Vorsichtsmaßnahmen, um die potenziell häufigen pathogenen Mechanismen zu untersuchen, die das primäre Sjögren-Syndrom und das Lungenadenokarzinom durch bioinformatische Analyse und experimentelle Verifizierung verbinden.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die potenziellen gemeinsamen pathogenen Mechanismen zu untersuchen, die das primäre Sjögren-Syndrom (pSS) und das Lungenadenokarzinom (LUAD) durch bioinformatische Analyse und experimentelle Verifizierung verbinden. Die relevanten Gene, die mit pSS und LUAD assoziiert sind, wurden aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank und der Genecard-Datenbank abgerufen. Anschließend wurden differentiell exprimierte Gene (DEGs), die mit pSS und LUAD assoziiert sind, als pSS-LUAD-DEGs gescreent. Es wurden Anreicherungsanalysen der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) und der Gene Ontology (GO) durchgeführt, um die signifikanten biologischen Funktionen von pSS-LUAD-DEGs aufzuklären. Die Kernziele wurden durch den Aufbau des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) identifiziert, wobei die diagnostische Genauigkeit der Hub-Gene durch ROC-Kurvenanalysen (Receiver Operating Characteristic) weiter bewertet wurde. In dieser Studie dienten NOD/Ltj-Mäuse als pSS-Tiermodelle und wurden mit Feinstaub 2,5 (PM2,5) stimuliert, um eine Entzündungsreaktion hervorzurufen. Für die relevante molekularbiologische Experimentverifizierung wurden quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Western Blotting eingesetzt. Die Ergebnisse der KEGG- und GO-Anreicherungsanalysen deuten darauf hin, dass Entzündungen eine entscheidende Rolle bei der Verknüpfung von pSS und LUAD spielen. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 und CEP55 wurden als Schlüsselziele von pSS-LUAD bestimmt. BALB/c-Mäuse und NOD/Ltj-Mäuse zeigten nach 21-tägiger Stimulation mit PM2,5 eine erhöhte Expression der inflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-1β im Lungengewebe, wodurch der JAK2/STAT3-Signalweg aktiviert und die Expression der tumorassoziierten Gene CCNA2, CCNB2 und CEP55 hochreguliert wurde, wobei NOD/Ltj-Mäuse ausgeprägtere Veränderungen aufwiesen als BALB/c-Mäuse. Dieses Protokoll zeigt, dass die durch die pulmonale entzündliche Mikroumgebung induzierte Karzinogenese ein Hauptgrund für die hohe Inzidenz von LUAD bei pSS-Patienten sein kann. Darüber hinaus können blockierungsbezogene Mechanismen dazu beitragen, das Auftreten von LUAD bei pSS-Patienten zu verhindern.

Einleitung

Das primäre Sjögren-Syndrom (pSS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch eine lymphozytäre Infiltration der exokrinen Drüsen gekennzeichnet ist und zu den klinischen Symptomen trockener Augen (Xerophthalmie) und Mundtrockenheit (Xerostomie) ^führt1,2. Die pSS wird in der Regel auch von extraglandulären Manifestationen der Beteiligung begleitet, einschließlich Hyperglobulinämie³, interstitieller Lungenerkrankung⁴, renaler tubulärer Azidose⁵, neurologischer Schädigung⁶ und Thrombozytopenie⁷, die die wichtigsten nachteiligen prognostischen Faktoren darstellen. In den letzten Jahren hat eine Reihe von Studien gezeigt, dass pSS im Allgemeinen mit einer erhöhten Prävalenz von Krebs einhergeht, einschließlich hämatologischer Malignome und solider Tumoren ^8,9,10. Lungenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen im Zusammenhang mit pSS, insbesondere das Lungenadenokarzinom (LUAD)¹¹.

Insgesamt deuteten weitere Untersuchungen darauf hin, dass pSS mit LUAD eine gemeinsame Pathogenese aufweisen könnte. Nach unserem derzeitigen Kenntnisstand gibt es noch keine speziellen Studien, die die gemeinsamen Mechanismen zwischen den beiden Erkrankungen erklären. In jüngster Zeit bietet uns die bioinformatische Analyse die Möglichkeit, potenziell gemeinsame Krankheitsmechanismen zwischen den Spezies^aufzudecken 12,13,14. Um die zugrundeliegenden Mechanismen weiter aufzudecken, wird die bioinformatische Analyse zur Analyse gemeinsamer Ziele und Signalwege zwischen pSS und LUAD verwendet, und anschließend werden Tiermodelle für die experimentelle Verifizierung etabliert. Die Aufdeckung dieser Mechanismen kann dazu beitragen, eine Evidenzbasis für die klinische Prävention von LUAD bei pSS-Patienten zu schaffen.

In dieser Studie wurden die Datenbanken GEO und Genecard verwendet, um die relevanten Gene abzurufen, die mit pSS und LUAD assoziiert sind. Anschließend wurden DEGs, die mit pSS und LUAD assoziiert sind, als pSS-LUAD-DEGs gescreent. Wir führten KEGG- und GO-Anreicherungsanalysen durch, um die signifikanten biologischen Funktionen von pSS-LUAD-DEGs aufzuklären. Der Aufbau eines PPI-Netzwerks wurde verwendet, um die Kernziele zu identifizieren, und wir bewerteten die diagnostische Genauigkeit der Hub-Gene durch ROC-Kurvenanalysen weiter. Wir verwendeten NOD/Ltj-Mäuse als pSS-Tiermodelle, die mit Feinstaub 2,5 (PM2,5) stimuliert wurden, um eine Entzündungsreaktion zu erzeugen. QPCR, ELISA und Western Blotting wurden durchgeführt, um die Studie experimentell zu verifizieren. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die durch die pulmonale entzündliche Mikroumgebung induzierte Karzinogenese ein kritischer Grund für die hohe Inzidenz von LUAD bei pSS-Patienten sein könnte. Es deutet auch darauf hin, dass das Auftreten von LUAD bei pSS-Patienten durch blockierungsbezogene Mechanismen verhindert werden kann.

Protokoll

Die Versuchstiere wurden in der Tierhaltung des China-Japan Friendship Hospital untergebracht, wo die Haltungsbedingungen der Tierfütterungsumgebung gemäß dem nationalen chinesischen Standard Laboratory Animal-Requirements of Environment and Housing Facilities (GB14925-2010) entsprachen. Alle Tierpflegeverfahren und -versuche entsprachen den ANARRIVE-Richtlinien und basierten auf den 3R-Prinzipien (Reduction, Replacement, Refinement) und den Richtlinien des National Animal Welfare Law of China. BALB/c-Mäuse wurden von SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. und NOD/Ltj-Mäuse von Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. gekauft.

1. Bioinformatische Analyse

1. Aufbereitung von Datensätzen
   1. Öffnen Sie die GEO-Datenbank (Gene Expression Omnibus) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)¹⁵, und verwenden Sie das primäre Sjögren-Syndrom und das Lungenadenokarzinom als Schlüsselwörter, um Genexpressionsprofile zu durchsuchen. Klicken Sie dann auf die Ergebnisse in der GEO DataSets Datenbank und wählen Sie Homo sapiens in Top Organisms aus. Wählen Sie das gewünschte Dataset zusammen mit den entsprechenden Plattforminformationen aus und laden Sie es herunter.
   2. Öffnen Sie die Genecard-Datenbank (https://www.genecards.org/)¹⁶ und verwenden Sie dasSjögren-Syndrom und das Lungenadenokarzinom als Schlüsselwörter, um die Gene von pSS und LUAD zu erhalten. Laden Sie die Tabellen der Krankheitsgene herunter.
2. Identifizierung gemeinsamer DEGs zwischen pSS und LUAD
   1. Laden Sie die R-Software herunter und öffnen Sie sie (https://cran.r-project.org/)¹⁷. Installieren Sie das R-Paket GEOquery, das R-Paket stringr, das R-Paket ggplot2, das R-Paket reshape2 und das R-Paket limma in der R-Software.
   2. Identifizieren und visualisieren Sie differentiell exprimierte Gene (DEGs) in verschiedenen GEO-Datensätzen (GSE84844, GSE51092, GSE32863 und GSE75037) mit der R-Software und vergleichen und analysieren Sie dann die Genexpression zwischen diesen Datensätzen. Betrachten Sie die Gene mit einem adjustierten P-Wert < 0,05 und einer Fold-Change (FC) > 1,2 oder < 0,83 als DEGs.
   3. Wählen Sie Gene mit einem Expressionsniveau größer oder gleich 20 aus, die mit pSS und LUAD in Verbindung stehen, aus der Genecard-Datenbank.
   4. Führen Sie die mit pSS verknüpften DEGs und die mit LUAD verknüpften DEGs sowohl aus der GEO-Datenbank als auch aus der Genecard-Datenbank zusammen.
   5. Installieren und laden Sie das VennDiagram-Paket in R, um die DEGs abzurufen und zu visualisieren, die pSS und LUAD (pSS-LUAD-DEGs) zugeordnet sind.
3. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Analyse der Anreicherung des Signalwegs
   1. Hier kommt Metascape (https://metascape.org/)¹⁸ ins Spiel. Klicken Sie auf Datei auswählen und laden Sie die Datei im .xlsx Format von pSS-LUAD-DEGs hoch. Wählen Sie H. sapiens in Eingabe als Spezies aus. Wählen Sie auf ähnliche Weise H. sapiens in Analyse als Spezies aus.
   2. Klicken Sie auf Benutzerdefinierte Analyse. Klicken Sie auf Anreicherung und wählen Sie KEGG Pathway aus. Klicken Sie auf Anreicherungsanalyse und dann auf Analyseberichtsseite , wenn die Anreicherungsanalyse abgeschlossen ist.
   3. Klicken Sie auf Alles in einer ZIP-Datei , um das Ergebnis herunterzuladen. Greifen Sie auf die Datei _ FINAL_GO.csv im Ordner Download Enrichment_GO zu, um das Ergebnis anzuzeigen.
   4. Verwenden Sie das ggplot2-Paket, um das Visualisierungsprogramm KEGG in R auszuführen.
4. Gen-Ontologie (GO) Anreicherungsanalyse
   1. Installieren und laden Sie clusterProfiler und enrichplot package in R.
   2. Importieren Sie die Liste im Textformat von pSS-LUAD-DEGs in R.
   3. Führen Sie die Pakete clusterProfiler und enrichplot für die GO-Anreicherungsanalyse und die Ergebnisvisualisierung aus. Definieren Sie die statistische Signifikanz in der Analyse bei einem angepassten p-Wert < 0,05.
5. Aufbau eines Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) und Modulanalyse
   1. Hier kommt die STRING-Datenbank (Retrieval of Interacting Genes) (http://string-db.org/)¹⁹ ins Spiel. Klicken Sie auf Durchsuchen und laden Sie die Datei von pSS-LUAD-DEGs hoch. Wählen Sie unter "Organismen" die Option "Homo sapiens" aus und klicken Sie auf "Suchen".
   2. Klicken Sie auf Weiter. Sobald die Ergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf Einstellungen. Wählen Sie unter Grundeinstellungen > Minimale erforderliche Interaktionsbewertung die Option Hohe Zuverlässigkeit (0,700) aus. Aktivieren Sie in den erweiterten Einstellungen das Häkchen bei Getrennte Knoten im Netzwerk ausblenden und klicken Sie dann auf Aktualisieren.
   3. Klicken Sie in der Titelleiste auf Exporte , um den PPI-Beziehungstext im TSV-Format herunterzuladen.
   4. Laden Sie die Cytoscape 3.7.1 Software (https://cytoscape.org/)²⁰ herunter und aktivieren Sie sie. Klicken Sie auf Datei > > Netzwerk aus Datei importieren , um die Datei im TSV-Format zum Erstellen des PPI-Netzwerks zu importieren.
   5. Verwenden Sie das Werkzeug Netzwerkanalyse , um die topologischen Parameter im Netzwerk zu analysieren. Optimieren Sie die Knotengröße und -farbe über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung.
   6. Wählen Sie in der Menüleiste Extras > Netzwerk analysieren aus. Klicken Sie im Bereich Tabelle auf Grad , um die Komponenten in absteigender Reihenfolge nach Grad zu sortieren. Nehmen Sie die Top 20 Gene mit höheren Graden als Hub-Gene.
   7. Installieren und laden Sie die Pakete igraph und ggplot2 in R, um Hub-Gene nach Grad zu visualisieren.
6. Identifizierung und Validierung von Hub-Genen
   1. Installieren und laden Sie das pROC-Paket in R.
   2. Importieren Sie die Liste der Hub-Gene im Textformat in R.
   3. Zeichnen Sie die ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) von Hub-Genen und berechnen Sie die Fläche unter den Werten der ROC-Kurve (AUC).
      HINWEIS: In der ergänzenden Codierungsdatei 1 finden Sie den R-Code zum Filtern von DEGs.

2. Experimentelle Verifizierung

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu den Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Zubereitung von Tieren
   1. Füttern Sie 1 Woche lang 12 neun Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse und 12 neun Wochen alte weibliche NOD/Ltj-Mäuse adaptiv.
   2. Verwenden Sie eine Zufallszahlentabelle, um 12 neun Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse gleichmäßig in die leere Kontrollgruppe und die PM2,5-Gruppe einzuteilen. Auf ähnliche Weise teilen Sie 12 neun Wochen alte weibliche NOD/Ltj-Mäuse gleichmäßig in die pSS-Gruppe und die pSS-PM2,5-Gruppe auf.
2. Vorbereitung der Suspension für Feinstaub 2,5 (PM2,5)
   HINWEIS: PM2,5 kann das Auftreten und die Entwicklung von entzündungsbedingter LUAD im Mausmodell²¹ induzieren. BALB/c-Mäuse und NOD/Ltj-Mäuse wurden durch PM2,5 dazu angeregt, entzündungsbedingte Veränderungen zu entwickeln. Gemäß der von Piao et ^al.22 beschriebenen Methode wurde die Konzentration der PM2,5-Suspension bei 1 mg/ml hergestellt.
   1. Wiegen Sie die PM2,5-Quarzfasermembranen, schneiden Sie sie in 2 cm × 2 cm große Stücke und tauchen Sie sie in ein Becherglas mit einer angemessenen Menge deionisiertem Wasser.
   2. Das Becherglas verschließen und in einem Wasserbad-Ultraschallgerät bei 37 °C jeweils 30 min beschallen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 Mal, bis sich die Partikel vollständig aufgelöst haben.
   3. Filtern Sie die Flüssigkeit im Becherglas durch 16 Schichten sterile medizinische Gaze und drücken Sie dann die Restfeuchtigkeit aus der Gaze heraus.
   4. Legen Sie das Filtrat auf eine flache Schüssel und frieren Sie es in einem -20 °C Gefrierschrank in Eisblöcken ein. Anschließend wird ein Gefriertrocknungsgerät (-52 °C, 0,1 mbar, 48 h) verwendet, um die Eisblöcke aus Filtrat zu trocknen und die pulverförmigen Partikel aufzufangen.
   5. Die pulverförmigen Partikel werden gründlich in Kochsalzlösung gelöst, um eine PM2,5-Suspension mit einer Konzentration von 1 mg/ml herzustellen. Gießen Sie die PM2,5-Suspension in eine Glasflasche, geben Sie sie in einen Hochdrucksterilisator und wenden Sie zur Sterilisation hohen Druck und hohe Temperatur (15 min bei 121 °C, 15 psi) an.
   6. Führen Sie ein Ultraschall-Rühren durch (200 W, 10 s Rühren, 10 s Ruhe, für 3 Zyklen). Lagern Sie es nach der Behandlung für die spätere Verwendung im 4 °C Kühlschrank.
3. Etablierung des PM2,5-Mausmodells
   HINWEIS: Der PM2,5-Gruppe und der pSS-PM2,5-Gruppe wurde 28 Tage lang einmal alle 3 Tage eine PM2,5-Suspension per Luftröhrentropf verabreicht, wobei jede Dosis 0,1 ml betrug. Der blinden Kontrollgruppe und der pSS-Gruppe wurde 28 Tage lang einmal alle 3 Tage physiologische Kochsalzlösung per Luftröhrentropf verabreicht, wobei jede Dosis 0,1 ml betrug.
   1. Injizieren Sie der Maus eine Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie, indem Sie überprüfen, ob keine Reaktion auf ein Zehenklemmen vorliegt und eine vollständige Muskelentspannung sichergestellt wird. Überwachen Sie kontinuierlich die Reflexe, die Atmung und das allgemeine Ansprechen, um sicherzustellen, dass während des gesamten Eingriffs eine angemessene Anästhesie aufrechterhalten wird, bis alle Schritte abgeschlossen sind.
   2. Positionieren Sie die Maus mit dem Bauch nach oben, dem Kopf nach oben und dem Schwanz in einem Winkel von 45° auf den Rückhalteapparat für Kleintiere. Ziehen Sie die oberen Schneidezähne der Maus mit einem feinen Faden nach oben und befestigen Sie den Faden an einer Schraube am Tierhalter, um sicherzustellen, dass die Mundhöhle der Maus vollständig freigelegt wird.
   3. Öffnen Sie die Kaltlichtlampe und leuchten Sie das Licht auf die Haut des Maushalses. Ziehe mit einer Pinzette die Zunge der Maus heraus und lege die Stimmritze vollständig frei. Beobachten Sie in der Mundhöhle der Maus einen wiederkehrenden sich öffnenden und schließenden Lichtpunkt, der die Position der Atemwegsöffnung der Maus anzeigt.
   4. Führen Sie die venöse Verweilnadel 18 G in die Luftröhre der Maus ein, ziehen Sie den Nadelkern heraus, platzieren Sie den Baumwollfaden am äußeren Ende der venösen Verweilnadel und bestätigen Sie den Erfolg, indem Sie beobachten, wie sich der Baumwollfaden mit den Brustbewegungen der Maus bewegt.
   5. Aspirieren Sie zuerst 0,2 mL Luft mit einer 1 mL Spritze, dann 0,1 mL PM2,5-Suspension und anschließend weitere 0,2 mL Luft. Injizieren Sie das Gemisch durch die venöse Verweilnadel 18 G in die Luftröhre.
   6. Ziehen Sie die venöse Verweilnadel 18 G heraus. Befestigen Sie den Tierhalter aufrecht und drehen Sie ihn 30 Mal im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, um die PM2,5-Suspension gleichmäßig in der Lunge der Maus zu verteilen. Strecken Sie dann den Hals der Maus gerade aus und legen Sie sie auf die Seite, um ein Ersticken zu verhindern.
4. Entnahme von Proben
   HINWEIS: Entnehmen Sie am 29^. Tag des Versuchs Proben für nachfolgende molekularbiologische Analysen.
   1. Überprüfen Sie die Verbindung des Euthanasiesystems und schalten Sie den Controller ein. Das Kohlendioxid (_{CO 2)-}Flaschenventil öffnen.
      HINWEIS: Füllen Sie die Euthanasiekammer nicht vor, bevor Sie die Tiere hineinsetzen.
   2. Setzen Sie die Mäuse in die Kammer und infundieren Sie CO₂ in einer Höhe von 30 % bis 70 % des Kammervolumens pro Minute. Setzen Sie die Mäuse 5 Minuten lang CO₂ aus und stellen Sie sicher, dass sie unbeweglich sind, nicht atmen und erweiterte Pupillen haben. Schalten Sie das CO₂ -Flaschenventil aus und beobachten Sie es weitere 5 Minuten lang, um den Tod zu bestätigen.
   3. Legen Sie die euthanasierte Maus in Rückenlage auf ein sauberes Präparierbrett. Legen Sie die Luftröhre, das Herz und die Lunge frei.
   4. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um die Haut und Muskeln zu entfernen, die den ventralen, Brust- und Halsbereich bedecken. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um Schnitte entlang der Rippenränder auf beiden Seiten der Brusthöhle zu machen, um die Brusthöhle freizulegen, in der sich Herz und Lunge befinden. Schneiden Sie dann das Schlüsselbein so ab, dass eine ausreichend breite Öffnung entsteht, um den linken und rechten Lungenlappen gründlich zu untersuchen.
   5. Schneiden Sie die Nackenmuskulatur heraus, die sich vom Brustbein und den Rippen bis zum Kiefer erstreckt. Führen Sie eine Schere unterhalb des vorderen Randes der Rippen ein und schneiden Sie auf beiden Seiten ein, um den knöchernen Teil zu entfernen, der die Luftröhre bedeckt.
   6. Fassen Sie die Luftröhre in der Nähe des Kiefers mit einer Pinzette und machen Sie einen vollständigen Querschnitt mit einer Schere, die über der Pinzette platziert wird.
   7. Ziehen Sie die Luftröhre vorsichtig mit einer Pinzette nach oben und schneiden Sie die Verbindungen des ventralen Gewebes mit einer Schere durch, bis das gesamte Brustgewebe aus dem Körper entfernt ist.
   8. Lege die Lunge flach auf die Werkbank. Die Oberflächenrückstände des Lungengewebes mit Kochsalzlösung abspülen, mit Filterpapier trocken tupfen, in Kryoröhrchen aliquotieren und bei -80 °C lagern.
5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
   1. Mahlen Sie das Lungengewebe mit einem Mörser, der flüssigen Stickstoff enthält, zu Pulver.
   2. Wiegen Sie 20 mg gemahlenes Gewebe mit einer Präzisionswaage, kombinieren Sie es mit 750 μl Puffer RL in einem Zentrifugenröhrchen, mischen Sie es gründlich mit einem Vortex-Mischer und lassen Sie es 3 Minuten bei Raumtemperatur (RT) stehen. Dann zentrifugieren Sie es bei 14.000 x g für 5 min bei RT und sammeln Sie den Überstand.
   3. Legen Sie die Minisäule des genomischen DNA-Filters (gDNA) in ein 2-ml-Entnahmeröhrchen. Den Überstand in die Mini-Säule des gDNA-Filters überführen und bei 14.000 x g für 2 min bei RT zentrifugieren.
   4. Entsorgen Sie die Mini-Säule des gDNA-Filters. Geben Sie ein gleiches Volumen von 70 % Ethanol in das Filtrat und mischen Sie, indem Sie es 5 Mal auf und ab pipettieren.
   5. Legen Sie die RNA-Minisäule in ein 2-ml-Sammelröhrchen. 750 μl des Gemischs in die RNA-Minisäule überführen und bei 12.000 x g für 1 min bei RT zentrifugieren.
   6. Verwerfen Sie das Filtrat und setzen Sie die RNA-Minisäule wieder in das 2-ml-Sammelröhrchen ein. Geben Sie 500 μl Puffer RW1 in die RNA-Minisäule und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 1 min bei RT.
   7. Verwerfen Sie das Filtrat und setzen Sie die RNA-Minisäule wieder in das 2-ml-Sammelröhrchen ein. Geben Sie 500 μl Puffer RW2 in die RNA-Mini-Säule. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 1 min bei RT. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
   8. Verwerfen Sie das Filtrat und setzen Sie die RNA-Minisäule wieder in das 2-ml-Sammelröhrchen ein. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 2 min bei RT.
   9. Übertragen Sie die RNA-Minisäule in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, geben Sie 100 μl RNase-freies Wasser in die Mitte der Säulenmembran und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang bei RT. Zentrifugieren Sie dann 1 Minute lang bei RT bei 12.000 x g . Entsorgen Sie die RNA-Minisäule und lagern Sie die RNA-Lösung bei -80 °C.
   10. Nehmen Sie 2 μl der RNA-Lösung und messen Sie sie mit dem NanoDrop-Spektralphotometer gemäß dem Gerätehandbuch, um ihre Konzentration und Qualität zu bestimmen.
       HINWEIS: In der Studie wurden die Verhältnisse 260/280 und 260/230 für die RNA-Qualitätskontrolle ausgewählt.
   11. Bereiten Sie die RNA-Lösung vor, indem Sie nacheinander die folgenden Komponenten in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben: 1 μg Gesamt-RNA, 4 μl MgCl₂ (25 mM), 2 μl reverse Transkription 10x Puffer, 2 μl dNTP-Gemisch (10 mM), 0,5 μl rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor, 15 Einheiten reverse Transkriptase, 0,5 μg Oligo(dT)_15-Primer , und fügen Sie nukleasefreies Wasser zu 20 μl hinzu. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig, um die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
       HINWEIS: Cocktaillösungen müssen zubereitet werden, um eine konsistentere cDNA-Synthese und RNA-Quantifizierung zu gewährleisten.
   12. Transkribieren Sie die 20-μl-RNA-Lösung in cDNA, indem Sie sie 15 Minuten lang bei 42 °C inkubieren, 5 Minuten lang bei 95 °C denaturieren und dann auf 4 °C abkühlen, gefolgt von einer Lagerung bei -20 °C.
   13. Kombinieren und mischen Sie 6,4 μl destilliertes Wasser, 10 μl SYBR Green Real-Time-PCR-Mastermix, 2 μl der erhaltenen cDNA-Lösung, 0,8 μl Forward-Primer (10 μM) und 0,8 μL Reverse-Primer (10 μM) (Tabelle 1), um das Reaktionssystem vorzubereiten.
   14. Führen Sie die Reaktion auf dem PCR-Gerät durch, um die Zyklusschwellenwerte (CT) für die Zielgene und Referenzgene zu erhalten.
       1. Die anfängliche Denaturierung ist zu Beginn jedes PCR-Zyklus für 60 s auf 95 ΰC einzustellen.
       2. Führen Sie während der PCR-Zyklen eine Denaturierung bei 95 °C für 15 s, ein Glühen bei 60 °C für 15 s und eine Extension bei 72 °C für 45 s durch, wobei während des Verlängerungsschritts Daten gesammelt werden. Führen Sie insgesamt 40 PCR-Zyklen durch.
       3. Führen Sie nach Abschluss der PCR-Zyklen automatisch eine Schmelzkurvenanalyse mit dem PCR-Instrument durch.
          HINWEIS: Wenn die Schmelzkurve einen doppelten Peak oder eine unregelmäßige Peakform zeigt, deutet dies darauf hin, dass möglicherweise ein Problem mit dem Experiment aufgetreten ist.
   15. Bestimmen Sie die relativen Expressionsniveaus jedes Zielgens mit der ^{2-ΔΔCT-Methode}, gefolgt von einer weiteren statistischen Analyse. Verwenden Sie die folgende Liste von Formeln für die ^{2-ΔΔCT-Methode}:
       ΔCT (Test) = CT (Ziel, Test) - CT (Ref, Test)
       ΔCT (Kalibrator) = CT (Ziel, Kalibrator) - CT (Ref, Kalibrator)
       ΔΔCT = ΔCT (Test) -ΔCT (Kalibrator)
       ^2-ΔΔCT = Faltige Veränderung der Genexpression

Name des Gens	Sequenz (5′ bis 3′)
Maus CCNA2 vorwärts	CCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Maus CCNA2 rückwärts	TTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Maus ASPM vorwärts	CTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Maus ASPM rückwärts	CCAGGCTTGAATCTTGCAG
Maus CCNB2 vorwärts	TTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Maus CCNB2 rückwärts	CTGTTCAACATCAACCTCCC
Maus NUSAP1 vorwärts	CTCCCTCAAGTACAGTGACC
Maus NUSAP1 umgekehrt	TTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Maus CEP55 vorwärts	CCGCCAGAATGCAGCATCAAC
Maus CEP55 Rückwärts	AGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

Tabelle 1: Prim-Sequenzen für die quantitative real-time PCR.

6. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
   HINWEIS: Äquilibrieren Sie das ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des ELISA-Kits auf RT, bereiten Sie einen Waschpuffer vor und verdünnen Sie den Standard. 90 μl konzentrierter biotinylierter Antikörper mit 8910 μl biotinyliertem Antikörperverdünnungspuffer verdünnen, um im Voraus eine biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung (1:100) herzustellen. In ähnlicher Weise verdünnen Sie 90 μl des konzentrierten Enzymkonjugats mit 8910 μl des Enzymkonjugat-Verdünnungspuffers, um im Voraus eine enzymkonjugierte Arbeitslösung (1:100) herzustellen.
   1. Mahlen Sie das Lungengewebe mit einem Mörser, der flüssigen Stickstoff enthält, zu Pulver.
   2. Wiegen Sie 50 mg Lungengewebe mit einer Präzisionswaage, kombinieren Sie es mit 1 ml PBS in einem Mahlröhrchen und mahlen Sie es gründlich auf Eis.
   3. Die Mischung wird bei 4 °C, 3000 x g für 5 min zentrifugiert und der Überstand als Probe entnommen.
   4. Geben Sie 100 μl der Probe/des Standards unterschiedlicher Konzentrationen in die entsprechenden Vertiefungen der ELISA-Platte, decken Sie die Reaktionsvertiefungen mit selbstklebender Dichtungsfolie ab und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang in einem 37 °C heißen Inkubator.
   5. Verwenden Sie eine automatische Plattenwaschmaschine, um die ELISA-Platte 4 Mal zu waschen, und injizieren Sie jedes Mal 350 μl Waschpuffer mit einem Intervall von 30 s zwischen Injektion und Aspiration.
   6. Geben Sie 100 μl biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung pro Vertiefung hinzu, verschließen Sie die Vertiefungen mit selbstklebender Dichtungsfolie und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang in einem 37 °C-Inkubator. Waschen Sie die ELISA-Platte anschließend 4 Mal nach dem zuvor beschriebenen Verfahren.
   7. Geben Sie 100 μl enzymkonjugierte Arbeitslösung pro Vertiefung hinzu, verschließen Sie die Vertiefungen mit selbstklebender Dichtungsfolie und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem 37 °C-Inkubator. Waschen Sie die ELISA-Platte anschließend 4 Mal nach dem zuvor beschriebenen Verfahren.
   8. 100 μl chromogenen Wirkstoffs pro Vertiefung zugeben, vor Licht schützen und in einem 37 °C heißen Inkubator für 10-20 min inkubieren. Fügen Sie dann 100 μl Stopplösung pro Vertiefung hinzu, mischen Sie gründlich und messen Sie sofort die optische Dichte bei Werten von 450 nm (OD₄₅₀).
      HINWEIS: Eine 8-Kanal-Pipette wird verwendet, um die biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung, die enzymkonjugierte Arbeitslösung und die Stopplösung hinzuzufügen, wodurch die Zugabe schnell abgeschlossen und potenzielle Fehler vermieden werden können.
   9. Generieren Sie mit der CurveExpert-Software (http:// curveexpert.webhop.net/) eine Standardkurve, um die Konzentration der Zielsubstanzen in jeder Probenvertiefung zu berechnen.
7. Western-Blotting
   1. Bereiten Sie die Lösung für den Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA) vor, indem Sie RIPA-Lysepuffer, Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und Phosphatasehemmer im Verhältnis 100:1:1 mischen und auf Eis legen.
   2. Mahlen Sie das Lungengewebe mit einem Mörser, der flüssigen Stickstoff enthält, zu Pulver.
   3. Wiegen Sie 20 mg Lungengewebe mit einer Präzisionswaage genau ab und geben Sie es zu 250 μl der RIPA-Mischlösung.
   4. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang auf Eis, zentrifugieren Sie sie dann 15 Minuten lang bei 4 °C bei 12.000 x g und entnehmen Sie den Überstand als Probe.
   5. Bereiten Sie die BCA-Arbeitslösung vor, indem Sie Reagenz A und Reagenz B aus dem BCA-Kit im Verhältnis 50:1 mischen.
      1. Verdünnen Sie den Standard, um verdünnte Standardlösungen mit Konzentrationen von 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 mg/ml herzustellen. Geben Sie 20 μl jeder Standardlösung und der Probe in separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
      2. Messen Sie die Extinktion bei 490 nm mit dem Mikroplatten-Reader. Die Standardkurve wird mit den Konzentrationen und Absorptionen der Standardlösungen angepasst und die Probenkonzentration²³ berechnet. Stellen Sie die Probenkonzentrationen mit der RIPA-Mischlösung auf das gleiche Niveau ein.
   6. Mischen Sie den Proteinüberstand mit 5x Ladepuffer im Verhältnis 4:1 in einem Zentrifugenröhrchen. In einem Metallbad 5 min kochen, dann bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen.
   7. Führen Sie eine Proteintrennung mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durch und übertragen Sie die Proteine elektrisch auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5 % Magermilch bei RT für 1 h.
   8. Die PVDF-Membran wird 12 Stunden lang mit einem Primärantikörper (verdünnt 1:1000) bei 4 °C inkubiert, anschließend dreimal 10 Minuten lang mit TBST gewaschen und dann mit einem Sekundärantikörper (verdünnt 1:5000) bei RT für 2 Stunden inkubiert.
   9. Erkennen Sie die Zielbanden mit einem vollautomatischen Elektrochemilumineszenz-Immunoassay-System und führen Sie eine quantitative Analyse mit der integrierten Software durch.
8. Statistische Analyse
   1. Verwenden Sie geeignete Software für die statistische Analyse.
   2. Präsentieren Sie die experimentellen Daten als Mittelwert ± Standardabweichung.
   3. Bestimmen Sie die Signifikanz mit Hilfe der unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA).
   4. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Insgesamt wurden 3290 DEGs aus den 23348 Genen in GSE84884 (pSS) identifiziert, darunter 2659 hochregulierte Gene und 631 herunterregulierte Gene (Abbildung 1A). Für GSE51092 (pSS) wurden insgesamt 3290 DEGs aus den 11409 Genen identifiziert, darunter 667 hochregulierte Gene und 587 herunterregulierte Gene (Abbildung 1B). Die GeneCards-Datenbank erhielt 102 ovarielle pSS-bezogene DEGs, und der Korrelationswert der Screening-Kri...

Diskussion

Obwohl die pSS als eine Krankheit gilt, die in erster Linie durch die Invasion exokriner Drüsen gekennzeichnet ist, kann die Schädigung der Extradrüsen nicht ignoriert werden²⁴. Die Lunge stellt ein Zielorgan für die pSS dar, und die Lungenbeteiligung ist eine häufige extraglanduläre Manifestation der pSS, die typischerweise mit einer lymphozytären Infiltration der Bronchialschleimhaut und des Lungeninterstitiums^{einhergeht 25}. Unters...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Color Prestained Protein Marker	Epizyme	WJ103	Western Blot
Antibody Dilution Buffer	Epizyme	PS119	Western Blot
BCA Protein Quantification Kit	Epizyme	ZJ101	Western Blot
Cytoscape 3.7.1 software	National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)	Version 3.7.1.	Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous Fluid	Epizyme	SQ203	Western Blot
Electrophoresis Buffer	Epizyme	PS105S	Western Blot
GraphPad Prism 10.0	GraphPad	Version 10.0	Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)	abclonal	AS014	Western Blot
JAK2 Antibody	Cell Signaling Technology	3230T	Western Blot
Mouse IL-1β ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0015	ELISA
Mouse IL-6 ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0006	ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF102	Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody	Cell Signaling Technology	3776S	Western Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) Antibody	Cell Signaling Technology	9145S	Western Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF101	Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)	Epizyme	PS108	Western Blot
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Western Blot
R software	R Foundation for Statistical Computing	Not Applicable	Statistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation Assay	Epizyme	PC101	Western Blot
Reverse Transcription System	Promega	A3500	PCR
SDS-PAGE	Epizyme	LK303	Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)	Epizyme	LT103	Western Blot
STAT3 Antibody	Cell Signaling Technology	9139S	Western Blot
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	PCR
TBST (10×)	Epizyme	PS103	Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)	Epizyme	PS109	Western Blot
β-Actin Antibody	abclonal	AC026	Western Blot