3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung

Zusammenfassung

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

Zusammenfassung

Retinale Perizyten sind essentiell für die Gefäßentwicklung und Stabilität der Netzhaut und spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität des retinalen Gefäßsystems. Um einen detaillierten Überblick über die morphologischen Eigenschaften von Perizyten zu erhalten, wurde in dieser Studie ein neuer Ansatz beschrieben, der die retroorbitale Injektion eines Fluoreszenzmittels, die Immunfluoreszenzfärbung und die Gewebereinigung kombiniert. Zunächst wurde das fluoreszierende Tomatenlektin in den retroorbitalen Sinus der lebenden Maus injiziert, um das retinale Gefäßsystem zu markieren. Nach 5 Minuten wurde die Maus getötet und ihre intakte Netzhaut vorsichtig aus dem Netzhautbecher entfernt und mit einem von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor-β immunfluoreszenzgefärbt, um die Perizyten freizulegen. Zusätzlich wurde die gefärbte Netzhaut mit einem gewebereinigenden Reagenz behandelt und als Ganzes auf den Objektträger aufgebracht. Durch diese Ansätze konnten die retinalen Gefäße und Perizyten in der transparenten Netzhaut deutlich beobachtet werden. Unter einem konfokalen Mikroskop erhielten wir mehr Möglichkeiten, hochauflösende Bilder aufzunehmen, um die morphologischen Eigenschaften von Perizyten entlang des retinalen Gefäßbaums in einer dreidimensionalen Ansicht weiter zu rekonstruieren und zu analysieren. Methodisch bietet dieses Protokoll einen effektiven Ansatz zur Visualisierung von Perizyten innerhalb des retinalen Gefäßsystems und liefert wertvolle Einblicke in ihre Rolle sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen.

Einleitung

Retinale Perizyten sind entlang der abluminalen Seite der vaskulären Endothelzellen in die Basalmembran eingebettet und zeigen ein netzartiges Muster von Prozessen mit kurzer Reichweite, die um die retinalen Blutgefäße gewickelt^{sind 1}. Dieser enge Kontakt zwischen den Perizyten und den retinalen Gefäßen trägt zur Aufrechterhaltung der Umwelthomöostase der Netzhaut^{bei 2}. Obwohl zahlreiche Studien morphologische Beweise für Perizyten im retinalen Gefäßsystem erbracht haben, stammt der größte Teil unseres Verständnisses der morphologischen Eigenschaften retinaler Perizyten aus konventionellen histologischen Techniken³.

In Übereinstimmung mit diesen Studien haben wir diese Studie so konzipiert, dass sie durch die Kombination traditioneller histologischer Techniken mit modernen wissenschaftlichen Methoden mehr morphologische Details von Perizyten in der retinalen Mikrovaskulatur effektiv darstellt. Der Ansatz integriert drei Schlüsseltechniken: die retroorbitale Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin in lebende Mäuse, die Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor-β (PDGFR-β) und die lösungsmittelbasierte Gewebereinigungsstrategie. Die retroorbitale Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin hat sich für die Beobachtung der retinalen Gefäße von Mäusen sowohl in vivo als auch in vitro als wirksam und zuverlässig erwiesen ^4,5. PDGFR-β dient als häufig verwendeter Biomarker für die Immunfluoreszenzfärbung von Perizyten⁶. Um hochauflösende Bilder von Perizyten in der dickeren und der ganzgelagerten Netzhaut aufzunehmen, verbessert die Gewebereinigungsstrategie die histologische Transparenz ^2,7,8.

Obwohl jede dieser Techniken einzeln in Netzhautstudien angewendet wurde, bleibt ihre kombinierte Kompatibilität für die Untersuchung von Perizyten in retinalen Gefäßen von Mäusen ungewiss. Da die durchschnittliche Dicke der Netzhaut der Maus etwa 180-220 μm^{beträgt 9}, führen die Antikörpermarkierung und die konfokale Bildgebung an diesem dicken Gewebe ohne Clearing-Behandlung häufig zu hohen Hintergrundsignalen, was die Beobachtung der räumlichen Beziehung zwischen Perizyten und Blutgefäßen erschwert¹⁰. Mit den hier beschriebenen Ansätzen wollen wir eine einfache Methode zur Visualisierung von Perizyten innerhalb des retinalen Gefäßsystems in einer dreidimensionalen (3D) Ansicht unter einem konfokalen Mikroskop bereitstellen. Diese verbesserten zellulären Informationen aus Perizyten im retinalen Gefäßsystem könnten unser Verständnis der retinalen Umwelthomöostase verbessern und potenzielle Strategien für den Gefäßschutz unterstreichen, wodurch die funktionellen Ergebnisse bei retinalen Gefäßerkrankungen verbessert werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Für diese Studie wurden drei junge erwachsene männliche C57BL/6-Mäuse (8-10 Wochen alt, mit einem Gewicht von 20-25 g) verwendet. Sie wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit untergebracht und hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der Chinesischen Akademie der Chinesischen Medizinischen Wissenschaften genehmigt (Zulassungsnummer 2023-03-14-04) und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt.

1. Retroorbitale In-vivo-Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin

1. Injizieren Sie 50 mg/kg Pentobarbital intraperitoneal, um die Maus zu betäuben. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie das Fehlen einer Reaktion auf einen Zehenkneifreiz bewerten.
2. Platzieren Sie die Maus in der rechten Seitenlage mit dem Kopf nach links.
3. Drücken Sie mit zwei Fingern vorsichtig auf den periorbitalen Bereich, um das linke Auge der Maus freizulegen und so die Injektion in den linken retroorbitalen Sinus des Tieres am einfachsten zu verabreichen¹¹.
4. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, die mit einer 27G-Nadel ausgestattet ist, um vorsichtig etwa 2-3 mm in den Orbitalvenensinus der Maus zu stechen, wobei die Abschrägung der Nadel in einem Winkel von 45° nach vorne zeigt.
5. Injizieren Sie 0,1 ml (1 mg/ml) fluoreszierendes Tomatenlektin in die Venenhöhle orbitalis der Maus.

2. Perfusion und Enukleation der Augen

1. 5 Minuten nach der retroorbitalen Injektion ist Tribromethanollösung (250 mg/kg) intraperitoneal zu injizieren, um die Maus tief zu betäuben. Anschließend wird das Tier durch Ausblutung und Herzperfusion eingeschläfert. Sobald die Atmung aussetzt, wird die Brusthöhle mit einer chirurgischen Schere¹² geöffnet.
2. Sobald die Atmung aufhört, öffnen Sie die Brusthöhle mit einer chirurgischen Schere. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente vorab und operieren Sie in einem Abzug. Verwenden Sie eine 24G-Nadel und führen Sie sie 2 mm durch die linksventrikuläre Spitze in den linken Herzventrikel ein. Führen Sie eine Perfusion mit einer Rate von 3 ml/min mit 20 mL 0,9 % physiologischer Kochsalzlösung durch, gefolgt von 20 mL 4 % Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH 7,4).
3. Lege die geopferte Maus auf die Seite und entferne mit einer Schere die Haut, die die Augen bedeckt. Entkernen Sie die Augen mit Schere und Pinzette.
4. Schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe ab, heben Sie dann das Auge heraus und geben Sie es auf eine 12-Well-Platte zur Nachfixierung in 4 % Formaldehyd in 0,1 M PB für 2 h.
5. Kryoschutz des Gewebes in 25%iger Saccharose in 0,1 M PB (pH 7,4) bei 4 °C, bis es auf den Boden der Lösung sinkt.
   HINWEIS: Da das Augengewebe in einer Saccharoselösung gut dehydriert, kann die Netzhaut leichter und vollständig abgelöst werden, was nachfolgende umfassende Studien erleichtert.

3. Dissektion der Netzhaut

1. Übertragen Sie die Augen mit einer Pasteur-Plastikpipette in eine Petrischale mit 0,1 M PB (pH 7,4).
2. Stechen Sie mit einer scharfen Schere in den Rand der Hornhaut, schneiden Sie um die Hornhaut und Iris herum und entsorgen Sie sie.
3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Linse und den Glaskörper zu entfernen. Ziehen Sie dann die becherförmige Netzhaut mit einer feinen Pinzette von der Mitte des Auges weg. Spülen Sie die Netzhaut mit 0,1 M PB (pH 7,4) in einer sauberen Petrischale.

4. Immunfluoreszenzfärbung und Gewebereinigung der Netzhaut

1. Entfernen Sie vorsichtig die becherförmige Netzhaut und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C in einer 2%igen Triton X-100-Lösung in 0,1 M PB (pH 7,4).
2. Die Netzhaut in die Blockierungslösung (0,1 M PB + 1 % Triton-X 100 + 0,2 % Natriumazid + 10 % normales Eselserum) übertragen und über Nacht bei 4 °C mit 72 U/min auf dem Shaker drehen.
3. Die Netzhaut wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen in die Lösung mit den Primärantikörpern von Ziegen-Anti-PDGFR-β (10 μg/ml) in einem Verdünnungspuffer (0,1 M PB + 0,2 % Triton-X 100 + 0,2 % Natriumazid + 1 % normales Eselsserum) übertragen und 2 Tage lang bei 4 °C auf dem Schüttler gedreht.
4. Waschen Sie die Netzhaut 2x mit Waschpuffer (0,1 M PB + 0,2 % Triton-X 100) bei Raumtemperatur und bewahren Sie sie dann über Nacht bei 4 °C im Waschpuffer auf dem Shaker auf.
5. Am nächsten Tag wird die Netzhaut in ein Mikrozentrifugenröhrchen in die gemischte Lösung überführt, die den 1 mg/ml-Sekundärantikörper des Esel-Anti-Ziegen-Antikörpers 488 und 0,2 ng/ml fluoreszierendes nukleäres 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält, und auf dem Schüttler 5 Stunden lang bei 4 °C bei 72 U/min drehen.
6. Waschen Sie die Netzhaut in einer 6-Well-Platte mit Waschpuffer für 1 h, 2x, bei Raumtemperatur. Halten Sie die Netzhaut über Nacht bei 4 °C im Waschpuffer auf dem Shaker. Führen Sie die Bildgebung und Analyse gemäß Schritt 5 durch, um die Ansichten vor der Gewebereinigung zu erhalten.
7. Übertragen Sie die Netzhaut auf das gewebereinigende Reagenz und drehen Sie es vorsichtig bei 60 U/min auf dem Schüttler für 1 h bei 37 °C.
8. Spülen Sie die becherförmige Netzhaut nach der Gewebereinigung mit 0,1 M PB (pH 7,4) in einer sauberen Petrischale.
9. Machen Sie mit einer Federschere 4 radiale Schnitte, die etwa 2/3 des Radius der Netzhaut erreichen, um eine Blütenblattform zu erzeugen.
10. Glätten Sie die Netzhaut und montieren Sie sie auf einen Objektträger, und entfernen Sie dann überschüssiges PB mit einem kleinen Stück saugfähigem Papier. Halten Sie die Innenseite der Netzhaut nach oben auf dem Objektträger.
11. Umkreisen Sie die montierte Netzhaut mit einem Abstandshalter und füllen Sie die Lücke mit frischem Gewebereinigungsreagenz und einem Deckglas.

5. Bildgebung und Analysen

1. Erhalten Sie die Außenansichten der Netzhaut vor (nach Abschluss von Schritt 4.6) und nach der gewebereinigenden Behandlung.
2. Scannen Sie die Montageansichten der beschrifteten Netzhaut mit dem Panorama-Gewebescheibenscanner. Verwenden Sie ein 2-fach-Objektiv mit einer NA von 0,08.
3. Nehmen Sie Bilder mit höherer Vergrößerung mit einem konfokalen Bildgebungssystem auf, das mit den folgenden Objektiven ausgestattet ist: 10-fach-Objektiv mit NA von 0,40 und 40-faches Objektiv mit NA von 0,95. Stellen Sie die konfokale Lochblende auf 152 μm (10x Objektiv) und 105 μm (40x Objektiv) ein. Legen Sie die räumliche Auflösung der Bildaufnahme auf 1024 x 1024 Pixel (10x Objektiv) und 640 x 640 Pixel (40x Objektiv) fest.
4. Nehmen Sie 50 Bilder (Z-Stack) in 2 μm Frames von der beschrifteten Netzhaut auf. Integrieren Sie alle Bilder in einem einzigen fokussierten Bild im Projektions-/Topografie-Modus. Klicken Sie für die Einrichtung auf Start-Fokusebene festlegen > End-Fokusebene festlegen > Schrittweite festlegen > Tiefenmuster auswählen > Image Capture > Z-Serie.
5. Aufnahme von Bildern mit den folgenden Anregungs- und Emissionswellenlängen für verschiedene Fluoreszenzsignale: Grüne Fluoreszenzsignale bei 499 nm und 519 nm; rote Fluoreszenzsignale bei 591 nm und 618 nm; und blaue Fluoreszenzsignale bei 401 nm und 421 nm.
6. Rekonstruieren Sie die Bilder im dreidimensionalen Muster, indem Sie konfokale Z-Stapel-Bilder in eine Analysesoftware importieren, indem Sie Neue Oberflächen hinzufügen > Lautstärkeeinstellungen auswählen > Quellkanal auswählen > Anzeige anpassen > Oberflächenwinkel > Schnappschuss anpassen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Aus der Außenansicht der Whole-Mount-Retina war die Gewebetransparenz der Whole-Mount-Retina durch die Tissue-Clearing-Behandlung im Vergleich zu der der Netzhaut ohne Tissue-Clearing erhöht (Abbildung 1).

Für die histologische Untersuchung der Whole-Mount-Netzhaut wurde das retinale Gefäßsystem durch die retroorbitale Injektion mit fluoreszierendem Tomatenlektin rot markiert, und die retinalen Perizyten sind mit PDGFR-β gr?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

In dieser Studie haben wir den technischen Prozess zur Demonstration der Morphologie von Perizyten in retinalen Gefäßen unter Verwendung der retroorbitalen Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin, der Immunfluoreszenzuntersuchung mit PDGFR-β und der lösungsmittelbasierten Gewebereinigung detailliert beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Techniken sehr gut für die Hervorhebung von Perizyten in der Whole-Mount-Netzhaut geeignet sind. Die Kombination dieser Methoden biete...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm