Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet polysomales Profiling zur Isolierung von Translatomen, mRNAs, die mit Ribosomen assoziiert sind, in nicht-polysomale und polysomale RNAs aus Arabidopsis durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode demonstriert die Translationseffizienz von hitzegestresstem Arabidopsis.

Zusammenfassung

Die translationale Kontrolle verschiedener Gene unter Hitzestress ist ein entscheidender Schritt für die Anpassung der Pflanzen an die Umwelt. Die Bewertung der translationalen Aktivitäten verschiedener Gene kann uns helfen, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Widerstandsfähigkeit von Pflanzen zugrunde liegen, und zur Entwicklung von Nutzpflanzen mit erhöhter Stresstoleranz angesichts des globalen Klimawandels beitragen. In diesem Artikel wird eine detaillierte Methodik zur Bewertung der Translationseffizienz durch Polysomen-Profiling in Pflanzen vorgestellt, die Hitzestress ausgesetzt sind. Das Verfahren gliedert sich in drei Teile: Hitzestressbehandlung für Arabidopsis, Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen und Berechnung der Translationseffizienz durch Isolierung von nicht-polysomaler und polysomaler RNA auf der Grundlage des Profils. Im ersten Teil werden Arabidopsis-Pflanzen kontrollierten Hitzestressbedingungen ausgesetzt, um Umwelteinflüsse nachzuahmen. Bei der Behandlung werden die Pflanzen für eine bestimmte Zeit hohen Temperaturen ausgesetzt, um eine konsistente und reproduzierbare Spannungsinduktion zu gewährleisten. Dieser Schritt ist entscheidend, um die physiologischen und molekularen Reaktionen der Pflanze auf Hitzestress zu untersuchen. Der zweite Teil befasst sich mit dem Test der Übersetzungseffizienz mittels Polysomenprofiling. Polysomen werden durch Saccharosegradientenzentrifugation extrahiert, bei der mRNAs basierend auf ribosomaler Beladung getrennt werden. Dies ermöglicht die Untersuchung der Ribosomenbelegung auf mRNAs und gibt Einblicke in die translationalen Kontrollmechanismen unter Stressbedingungen. Im dritten Teil wird RNA sowohl aus polysomalen als auch aus nicht-polysomalen Fraktionen isoliert. Spike-in-RNA wird verwendet, um die Menge an RNA in jeder Fraktion genau zu messen. Die Berechnung der Translationseffizienz erfolgt durch den Vergleich der Verteilung von mRNAs über diese Fraktionen unter Normal- und Hitzestressbedingungen. Die Translationsaktivitäten spezifischer Gene werden durch quantitative real-time PCR (qRT-PCR) mit Ribosomen-assoziierter RNA und Gesamt-RNA weiter bewertet. Diese Methodik konzentriert sich ausschließlich auf die Auswirkungen von Hitzestress und bietet ein detailliertes Protokoll zur Analyse der translationalen Regulation in Pflanzen.

Einleitung

Die Translation ist für Organismen von entscheidender Bedeutung, um funktionelle Proteine aus mRNA zu synthetisieren, die essentielle zelluläre Funktionen und biologische Prozesse wie Stoffwechsel und Signalübertragung unterstützen und Stressreaktionen ermöglichen. Ohne Translation können Zellen keine lebenswichtigen Proteine produzieren, was sich auf ihre Struktur, Funktion und Regulation auswirkt und dadurch die Erhaltung des Lebens und die Förderung der biologischen Vielfalt beeinträchtigt ^1,2. Daher ist die Untersuchung der translationalen Effizienz von Pflanzen von entsch....

Protokoll

1. Vorbereitung der mit Hitze behandelten Arabidopsis-Sämlinge

1. Platten 250 Samen für jedes Replikat und jeden Zustand mit einer Pipette auf das Filterpapier legen, das auf die Agarplatte des Basalmediums Murashige und Skoog (MS) ohne Saccharose (pH 5,6) gelegt wird, ergänzt mit 1,2 % Phytoagar.
   HINWEIS: Um Sämlinge auf MS-Platten zu pflanzen, wird steriles Filterpapier auf die Platte gelegt, um zu verhindern, dass die Sämlingswurzeln tief in das Medium eindringen, was die Probenahme erleichtert. Anschließend werden die Samen auf das Filterpapier gepflanzt. Um de....

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und standardisierte Methode zur Messung der Translationseffizienz von Arabidopsis-Sämlingen. Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die Sicherstellung der RNA-Stabilität durch Sekundärzentrifugation und RNA-Extraktionsreagenzienextraktion sowie die sorgfältige Vorbereitung des Saccharosegradienten. Darüber hinaus bieten wir kritische Schritte zur Normalisierung und Quantifizierung der nicht-polysomalen und polysomalen RNA mit der Spi.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile