RNA-Analyse von Umweltproben mittels RT-PCR

(1) Entnahme von Proben: Bodenprobe

1. Suchen Sie eine Probe Position über GPS-Koordinaten oder aus den Augen.
2. Wählen Sie für zufällige Stichproben Zufallspunkte innerhalb eines Bereichs um eine allgemeine Volkszählung mikrobielle Habitate zu erhalten. Transekt Sampling sammelt von Punkten entlang einer geraden Linie, z.B.neben einem Bachbett. Raster-Proben sind systematisch Punkte in regelmäßigen Abständen entnommen und eignen sich für Zuordnung mikrobieller Gemeinschaften in einem Gebiet, unbekannt oder variabel.
3. Probenahme in einem 3 bis 6 Zoll (7,5-15 cm) bietet tiefe Zugriff auf die am häufigsten vorkommende mikrobielle Aktivität, die in der Nähe, aber nicht in der Rhizosphäre (die schmale Region des Bodens direkt betroffen von Pflanzenwurzeln und ihre damit verbundenen Mikroorganismen) ist.
4. Um die Bodenprobe zu erfassen, drücken Sie und drehen Sie eine Hand-Schnecke in den Boden auf die vorgegebene Tiefe.
5. Heben Sie die Schnecke. Der Boden wird innerhalb der hohlen Stiel der Schnecke gefunden.
6. Kratzen Sie den Boden an der Unterseite der Schnecke in eine Boden-Fangsack. Achten Sie darauf, nicht zu berühren oder den Boden zu verunreinigen.
7. Beschriften Sie die Tasche richtig mit Standort, Name, Datum und Uhrzeit.
8. Durchlaufen Sie im Labor den Boden eine 2-mm-Sieb um Kies und Felsen zu entfernen.
9. Einen Teil des Bodens für Bodenfeuchte zu analysieren. Einzelheiten zu diesem Schritt siehe Jupiter Science Education video auf Bodenfeuchte.

2. Beispiel-Sammlung: Wasserprobe

1. Finden Sie den Probe-Standort per GPS, Koordinaten oder aus den Augen.
2. Sammeln Sie das Wasser in einer Vorratsflasche. Das Volumen des aufgefangenen Wassers zu erfassen; Wenn Mikroben in der Probe quantitativ untersucht werden, kann die mikrobielle Konzentration basierend auf den gesammelten Volumen ermittelt werden.
3. Testen Sie sofort das Wasser für alle Parameter erforderlich für das Experiment (Temperatur, pH-Wert, Leitfähigkeit, Salzgehalt, Stickstoff und Phosphor Inhalt, etc.) mit der entsprechenden elektronischen Sonden.
4. Stellen Sie die Flasche mit der Wasserprobe in eine Kühlbox mit Eis. Übertragen Sie den Kühler an das Labor.

(3) RNA-Extraktion

1. Zu sammeln und Mikroorganismen aus der Umwelt Probe zu konzentrieren, entnehmen Sie bitte dem Jupiter Science Education video-on-Gemeinschaft Nukleinsäure-Extraktion.
2. Viren mit einem kommerziellen Extraktion-Kit nach Herstellerangaben extrahieren Sie RNA.
3. Kurz, zunächst die Proben mit Lyse Puffer ergänzt mit Ethanol mischen, dann die Proben in Spin Spalten hinzufügen.
4. Zentrifugieren Sie die Spalten bei ca. 12.000 x g, verwerfen Bestrahlungskammer. Die Spalten Waschpuffer hinzufügen und erneut zentrifugieren.
5. RNase-freies Wasser hinzufügen, um die Spalten und die Zentrifuge für 30 s an RNA in sterilen 1,5 mL niedrigem Kraftschlußbeiwert Microfuge Röhren eluieren.

(4) reverse Transkription - PCR

1. Die folgenden Reagenzien von-20 ° C-Gefrierschrank abrufen: dNTP, konzentriert (z.B. 10 X) reverse Transkription Puffer, Primer (in diesem Beispiel, zufällige Primer). Tauen Sie diese auf Eis oder bei Raumtemperatur innerhalb eine cleane Motorhaube, und halten sie auf dem Eis einmal aufgetaut. Auch abgerufen Sie die Reverse Transkriptase und RNase-Inhibitor und halten sie auf dem Eis.
2. Die Reagenz Volumina erforderlich, um eine "master-Mix", die alle Reagenzien verbindet konstant unter jede Reaktion zu berechnen (siehe Tabelle 1 für eine Probe-Reaktion). Bereiten Sie genügend master-Mix für jede Probe sowie eine Positivkontrolle (mit einer bekannten Protokoll-Vorlage) und negative (z.B.ohne Reverse Transkriptase, mit nur Wasser als Vorlage, etc.) Reaktionen zu kontrollieren. Enthalten Sie 10 % extra Volumen.
3. Montieren Sie den master-Mix in 1,5 mL niedrigem Kraftschlußbeiwert Microfuge Röhren. Dadurch wird die Bindung von Reagenz-Molekülen, die Rohre Kunststoffwände minimiert.
4. Wenn Reagenzien aufgetaut sind, fügen Sie berechnete Volumen das Microfuge Rohr hinzu. Sanft Wirbel und Zentrifugieren jedes Röhrchen vor der Addition. Achten Sie darauf, die Pipette Spitzenwechsel zwischen dem Hinzufügen jedes Reagens um Verunreinigungen zu verhindern.
5. Nachdem alle Reagenzien sind hinzugekommen, Wirbel und Zentrifuge der master-Mix um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Reagenzien in Lagerung bei-20 ° c zurückgestellt
6. Bereiten Sie vor und beschriften Sie 8-Röhre PCR-Streifen, eine Röhre für jede Probe oder Kontrolle Reaktion benannt.
7. Aliquoten ein gleiches Volumen des master-Mix in jedes Rohr. Fügen Sie dann die Reaktion-spezifische Komponenten, wie z. B. die RNA-Extrakte.
8. Legen Sie die Streifen Kappe sicher auf den PCR-Streifen und Zentrifugieren in einem Minicentrifuge mit einem Streifen-Rohr-Adapter um sicherzustellen, alle Flüssigkeit am unteren Rand jedes Rohr (Abbildung 2) gesammelt werden.
9. Ort-PCR-Streifen sicher im Thermocycler. Drücken Sie, um sicherzustellen, dass die Rohre befestigt sind.
10. Festlegen der Thermocycler zum Ausführen des Programms für die RT verwendet wird (siehe Tabelle 2 für ein Probe-Protokoll). Wenn das Programm abgeschlossen ist, werden die Rohre cDNA Produkte enthalten, die dann PCR Verstärkung unterworfen werden können. Bitte Einzelheiten Sie zu den Jupiter Science Education Videos auf PCR und quantitative PCR. CDNA bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.

Abbildung 2. Angeschnittene Ärmel 8-Röhre Streifen mit master-Mix und Extrakt.

Reagenz	Volumen pro 1 Reaktion (μL)
10 x RT Buffer	2.0
25 x dNTPs	0,8
10 x zufällige Primer	2.0
Multiscribe	1.0
RNase-Inhibitor	1.0
Molekularen Klasse H2O	3.2
Gesamtvolumen	10

Tabelle 1. RT-Master Mix Zutaten.

Schritt 1	Schritt 2	Schritt 3	Schritt 4
25 ° C, 10 min	37 ° C, 120 min.	85 ° C, 5 min	4 ° C, ∞

Tabelle 2. RT-Reaktion-Thermocycler-Programm.