Harvesting Knochenmark aus Oberschenkel-und Schienbein <ol><li> Der erste Schritt des Verfahrens ist es, dem Knochenmark aus dem Oberschenkel-und Schienbein einer 6 Ernte - bis 12-Wochen alten Maus (wir sind mit BALB / c-Mäusen, aber Sie können diesen Vorgang mit jeder Maus-Stamm zu tun). Um zu beginnen, euthanize der Maus durch CO 2-Inhalation (wird nicht angezeigt). Ernte Oberschenkelknochen und Schienbein von den Hinterbeinen eines jeden. Dann, mit einer Rasierklinge geschnitten jedem Ende der Oberschenkel auf die Hüft-und Kniegelenke zu entfernen und bis auf die Knochen freizulegen. </li><li> In ähnlicher Weise geschnitten jedem Ende der Tibia, die Knie-und Sprunggelenk angrenzenden Regionen zu entfernen und bis auf die Knochen freizulegen. </li><li> Nehmen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel und füllen es mit RPMI mit 10% FBS, Penicillin, Streptomycin und beta-Mercaptoethanol (BME = 100 uM) ergänzt. Mit Pinzette, halten Sie die Knochen über eine Petrischale mit RPMI-Medien. Legen Sie die Nadel der Spritze in das eine Ende des Knochens und drücken Sie den Kolben zu spülen, das Knochenmark. Die Kanüle kann auf und ab bewegt im Inneren der Knochen zu spülen verbleibende Knochenmark werden. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für alle die Knochen, und fahren Sie dann mit Gründung der Kulturen. </li></ol> Gründung Kulturen <ol><li> Zum Aufbau der Knochenmark-Kulturen, die Pipette gespült Knochenmark nach oben und unten mehrmals zum Aufbrechen der Gewebe in einer Zellsuspension. </li><li> Legen Sie einen 70-Mikron-Filter auf einem 50 mL konischen Rohr, und fügen Sie die Zellsuspension auf den Filter. </li><li> Spülen Sie die Petrischale einmal mit RPMI, fügen Sie dann die zu den 70-Mikron-Filter zu spülen. </li><li> Mit dem Gummi Ende einer 1 mL Spritzenkolben, schleifen das Knochenmark Stücke übrigen auf der 70-Mikron-Filter. </li><li> Waschen Sie den Filter einmal mit RPMI. </li><li> Nach dem Waschen der Filter, Zentrifugen der Zellsuspension bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Zellpellet durch Resuspendieren in PBS. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Wir in der Regel erhalten ~ 90 Millionen Zellen von einer Maus die Knochen (zwei Oberschenkelknochen sowie zwei tibiae). Nach Auszählung der Zellen, Zentrifuge sie wieder bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge RPMI und aliquoten sie in Zellkulturflaschen mit RPMI genug, so dass die Endkonzentration 1 Million Zellen pro ml ist. </li><li> Add Zytokine auf die Entwicklung Ihres Zelltyp von Interesse zu fördern. In diesem Fall ist das Zytokin Interleukin-3 (IL-3 = 10 ng / mL) zugegeben, um die Entwicklung von Basophilen und Mastzellen zu fördern. Zum Erwerb Basophile, für 10 Tage bebrüten. Für Mastzellen, für 5 Wochen bebrüten. Bei der Generierung von Mastzellen, die Medien und IL-3 sollte einmal pro Woche gewechselt werden. </li><li> Hier ist ein Blick darauf, wie Mastzellen sollten unmittelbar nach der Beschichtung auftreten. Dieses Bild zeigt die Differenzierung der Mast Knochenmarkzellen in Basophilen und Mastzellen 10 Tage nach der Zugabe von Interleukin-3. </li><li> Sobald die gewünschten Zelltyp erhalten, mit der Elektroporation Schritt fort. </li></ol> Elektroporation Cells <ol><li> Zu Beginn der Elektroporation Schritt bestimmen die Anzahl der Zellen in der Kulturflasche. </li><li> Cells sind typischerweise bei einer Dichte von 10 Millionen pro ml elektroporiert, so übertragen die erforderliche Zellzahl auf konische Röhrchen und zentrifugieren bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Nach dem Zentrifugieren absaugen Medien, waschen Sie die Zellen mit 1X PBS, und Zentrifuge wieder bei 1200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie das PBS und fügen Bio-Rad Gene Pulser Elektroporation Puffer, um eine Zellsuspension von 10 Millionen Zellen pro ml zu machen. </li><li> Nach dem Resuspendieren der Zellen, fügen Sie die gewünschten Plasmid-DNA in einer Endkonzentration von 10 bis 20 Mikrogramm pro Milliliter. </li><li> Aliquot 150 Mikroliter der Zellsuspension in die Vertiefungen Ihrer Wahl auf eine 96-Well Platte Elektroporation. </li><li> Legen Sie die Elektroporation Platte in der MXcell Platte Kammer und den Deckel schließen. </li><li> Vor der Transfektion von Mastzellen, muss eine Elektroporation Protokoll in die MXcell es sei denn, mit einem vorgegebenen oder gespeicherte Protokoll programmiert werden. Durch Optimierung Experimenten haben wir herausgefunden, dass die höchste Transfektionseffizienz von Mastzellen kommen mit Rechteckimpuls-Protokolle. Wir werden die Elektroporation Bedingungen auf der Platte zu variieren, um 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms und 350V/10ms Rechteckimpulse bei 2000uF und 1000 Ohm zu liefern. Sobald das Protokoll festgelegt wurde und geladen auf das Gerät, drücken Sie &quot;Pulse&quot;, um die Zellen elektroporieren. </li><li> Nach der Elektroporation abgeschlossen ist, übertragen Sie die Zellen einer Gewebekultur Platte. Wir typischerweise Transfer je 150 Mikroliter Elektroporation Probe auf ein gut in einer 48-well Zellkultur-Platte mit 300 Mikroliter RPMI (ergänzt mit 10% FCS, Penicillin, Streptomycin und beta-Mercaptoethanol) mit 10 Nanogramm pro ml Interleukin-3. Die Zellen werden über Nacht bei 37 ° C, dann analysiert 24 Stunden später für die Expression und Unterdrückung. </li></ol> Transfection Ergebnisse Die Fluoreszenz-Mikroskopie Bild der Zellen nach erfolgreicher Elektroporation mit 20 Mikrogramm pro ml GFP-Plasmid ist in dem Video zu sehen. Mit dem MXcell Elektroporationssystem Transfektionseffizienz von ca. 30% erzielt werden kann. Das System ermöglicht Ihnen, die Bedingungen zu Ihrem Transfektionseffizienz zu maximieren variieren, dabei jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen.

Da immer mehr genomische Information entsteht und neue Werkzeuge wie siRNA entwickelt werden, hat die Verwendung von physiologisch relevanten Zellen immer mehr an Bedeutung für unser Verständnis der Krankheit Wege, Protein-Protein-Interaktionen und Signaltransduktion weiter. Primäre Zellen werden direkt von Geweben oder Flüssigkeiten gewonnen und in vitro kultiviert. Diese Zellen können in eine Reihe von Möglichkeiten, unter anderem durch die Einführung von exogenen genetischen Materials verändert werden. Es wird immer offensichtlicher, dass der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primäre Zellen einzuschleusen Elektroporation ist. Elektroporation macht Zellen in elektrische Impulse um vorübergehend erhöhen die Durchlässigkeit der Zellmembran, wodurch exogene Nukleinsäuren in die Zelle eindringen. Diese Methode der Transfektion optimiert, um die Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen / Leitungen und somit können an Mastzellen transfizieren werden sowie alle anderen Knochenmark stammende Zellen unterzubringen. Außerdem, im Gegensatz viral-vermittelte Transfektion, Elektroporation ist nicht Grenzen für die Größe der transfizierten DNA, noch erfordert umfangreiche Vorbereitungen. Im Gegensatz zu Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation kann weniger toxisch sein und nicht in endosomalen Abfangen der transfizierten Nukleinsäure führen. Bio-Rad hat die MXcell Elektroporation, das speziell für diese Zellen entwickelt. die MXcell können Sie variieren, um Ihre Transfektionseffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Um die Transfektionseffizienz zu optimieren und Zelltod, eine Vielzahl von Elektroporation Parameter einschließlich Spannung, können Kapazität, Widerstand, und Pulslänge eingestellt und bewertet werden.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser MXcell Electroporation System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Electroporation Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow for electroporation

Es wird immer deutlicher, dass die Elektroporation der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primären Zellen einzuführen. Die Gene Pulser MXcell Elektroporation und Gene Pulser Elektroporation Puffer wurden speziell entwickelt, um Nukleinsäuren in Säugerzellen und schwer zu transfizieren Zellen, wie Primär-und Stammzellen cells.This Video transfizieren demonstriert, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren , und dann bereiten sie für die Elektroporation in den MXcell System. Wir beginnen mit der Isolierung von Ober-und Unterschenkels. Knochenmark aus beiden Ober-und Unterschenkels werden dann geerntet und Kulturen etabliert. Cultured Knochenmarkzellen werden dann transfiziert und analysiert.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Dieses Verfahren beschreibt, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren und wird durch Transfektion mit dem Gene Pulser MXCell Elektroporation Systems.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Forschung

Genetik

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Immunologie und Infektion

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Biologie

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Optimierung der Isolierung von Stromazellen aus Thymus und Knochenmark

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der hämatopoetischen Forschung mit Stromazellisolierung für die Einzelzellsequenzierung

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

Transkript

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen