Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund, Genome British Columbia und der British Columbia Ministry of Forests und Range für die Unterstützung laufender Studien der Waldboden Produktivität danken. SL wurde durch ein Stipendium von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.

Teil I: Die Extraktion von DNA Verfahren 1. 8 Stunden benötigt werden, für die Verarbeitung von 6 Proben ohne Quantifizierung von DNA. Bevor Sie die Extraktion zu starten, werden Sie vor Kälte Mörtel, Pistill und Spatel in einem -20 ° C Gefrierschrank oder mit flüssigem Stickstoff benötigen. Auch vor Kälte 50 ml Röhrchen mit 20 ml Chloroform Isoamylalkohol (24:1) auf Eis. Stellen Sie die Hybridisierung Backofen auf 65 ° C vorheizen. Überprüfen Sie CTAB-Lösung, wenn es warm kristallisiert wird auf 60 ° C, um die Kristalle schmelzen. Füllen Sie das Denaturierungslösung und Extraktionspuffer, indem Sie die letzten Zutaten kurz vor der Extraktion (siehe Rezept unten) beginnen. Führe alle Extraktionsverfahren in einem Abzug. 2. Bereiten Sie die Denaturierungspuffer und Extraktionspuffer. Hinweis: Um die DNA-Ausbeute zu maximieren, ist es wichtig, genau zu machen Puffer den Anweisungen folgen. 3. Platz 2 g Boden in einem vorgekühlten Mörser. Hinweis: Der Boden in dem Gebiet gesammelt haben, sollten auf Trockeneis für den Transport eingefroren und bei -80 ° C. Tauwetter und Sieb Boden mit einem 2 mm Sieb vor der DNA-Extraktion. Sie können den Grundbetrag von Boden bis zu 10 g. erhöhen 4. 1 ml der denaturierenden Lösung auf den Boden. 5. Freeze und schleifen den Boden in flüssigem N 2 mit einem Stößel, bis der Boden Partikel pulverförmigen und homogenes Aussehen anstreben. Wiederholen Sie das Einfrieren und Schleifen zweimal. Hinweis: Bewahren Sie die Bodenprobe eingefroren während des Schleifens, mit genügend flüssiger Stickstoff zur Deckung der Bodenprobe. Leichte Schmelzen während des Schleifens ist akzeptabel. 6. Übertragen Sie die in das Erdreich in einen 50 ml konischen Rohr mit einem vorgekühlten Spatel. Hinweis: Der Boden Bodenprobe kann bei -80 ° C an dieser Stelle, wenn nötig gespeichert werden. 7. Add 9 ml Extraktionspuffer. Um die Lösung und Boden, kurz vortexen bei geringer Geschwindigkeit mischen. Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Puffer ist homogen, warm bei 60 ° C für 10-15 Minuten vor dem Gebrauch. Halten Sie den Rest der Puffer bei 60 ° C während der Extraktion. Vortex bei der Geschwindigkeit 8 (auf einer Skala, wobei 10 das Maximum). 8. Inkubieren für 40 min bei 65 ° C in einem Hybridisierungsofen. Während der Inkubation kontinuierlich drehen die Rohre bei niedrigster Drehzahl, oder durch vorsichtiges Umdrehen der Röhrchen alle 10 min. Hinweis: Legen Sie das Rohr horizontal in einem Hybridisierungsofen, damit Puffer Boden über eine große Fläche zu kontaktieren. Die Lösung kann ein wenig viskosen während der Inkubation zu suchen. 9. Zentrifuge bei 1800 x g, 10 min bei 10 bis 14 ° C. Transfer in die vorgekühlte 50 ml konische Röhrchen mit 20 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) den Überstand auf Eis zu halten. Hinweis: Wenn Sie Überstand zu übertragen, darauf achten, nicht die organische Schicht (untere Schicht) zu stören. Lassen Sie 1-2 ml Überstand, wenn es um nur saubere Überstand sammeln notwendig ist. Oft sehen Sie eine beige Schicht (ca. 1-3 mm dick) auf der Oberseite des Überstandes. Bitte nicht stören diese Schicht bei der Erhebung der Überstand. Versuchen Sie, die Spitze entlang der Rohrwand slide zu einem Bruch dieser beige Schicht zu verhindern. Wenn der Überstand zu trübe ist, wiederholen Sie die Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion ein weiteres Mal auf den Überstand. Verwenden Sie keine Einweg-Kunststoff-Pipetten bei der Übertragung von Chloroform, wie Chloroform wird die Kunststoffschmelze. Verwenden Sie eine Glaspipette oder einem Glas-Messzylinder, oder gießen Chloroform direkt in 50 ml konische Röhrchen. 10. Auszug des Bodens Pellets 2 weitere Male; 10.1. 5 ml Extraktionspuffer in den Boden Pellets, vorsichtig mischen mit 1 ml Spitze von kurzen Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit an. Hinweis: Shake und mischen Sie die Puffer vor dem Gebrauch. 10.2. Inkubation bei 65 ° C für 10 min in Hybridisierungsofen. Zentrifuge bei 1800 x g, 10 min bei 10 bis 14 ° C. Überstand in die Röhre bei Schritt 9 fort. Halten Sie das Röhrchen mit gesammelten Überstand und Chloroform-Isoamylalkohol auf Eis während der Extraktion. Hinweis: Achten Sie darauf, fügen Sie den Überstand in das gleiche Rohr ohne Kreuz Vermischung zwischen den Proben. 10.3. Wiederholen 9.1 und 9.2 noch einmal. 11. Mit einem Drehteller, sehr sanft Rock die Röhre, die die gesammelten Überstand (14-19 ml) und Chloroform-Isoamylalkohol bei 1,25 min für 10 min enthält. Hinweis: Schließen Sie den Deckel sehr fest, um ein Auslaufen zu verhindern. Legen Sie ein Papiertuch auf dem schaukelnden Platte, bevor Sie das Rohr so ​​eventuelle Lecks leicht erkannt werden kann Platz. 12. Zentrifuge bei 1800 x g, 20 min bei 10 bis 14 ° C. 13. Transfer wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Hinweis: Bitte nicht stören der Interphase zwischen der wässrigen Phase (obere Schicht) und die organische Schicht (untenSchicht), wenn Sie den Überstand zu übertragen. Lassen Sie ca. 1,5 bis 2 ml Überstand Sammlung nur saubere Überstand zu gewährleisten. 14. Stellen Sie die DNA mit Isopropanol (Schritt 15.a - 21.a). Alternativ können Sie Amicon ® Ultra-15 Zentrifugalfilter Devices (Schritt 15.b - 21.b), wenn Sie sehr geringe Menge an Biomasse in Ihrer Probe, die kaum sichtbare Pellet durch Isopropylalkohol Niederschläge, die nur schwer wieder erholen wird produzieren erwarten. 15.a Setzen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen Ultrazentrifuge. 16.a. Add Isopropylalkohol, um die gesammelten Überstand bei einem Volumenverhältnis von 0,6:1. Kehren Sie die Röhren vorsichtig ein paar Mal zu mischen. 17.a Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur. 18.a. Zentrifugation bei 16000 x g, 20 min bei 20 bis 25 ° C. Sicherstellen, dass die Gewichte aller Röhren sind gut vor dem Zentrifugationsschritt ausgeglichen. Hinweis: Markieren Sie die Richtung der Zentrifugalkraft auf die Tube, so kann man das DNA-Pellet leichter erkennen, wenn die DNA-Ausbeute ist gering. 19.a. Entfernen Sie Isopropylalkohol durch Dekantieren oder Vakuum abgesaugt. Achten Sie darauf, das DNA-Pellet stören. Hinweis: Entfernen Sie Isopropylalkohol sobald Zentrifugation abgeschlossen ist. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht auf die DNA-Pellet zu verlieren. Die Größe der DNA-Pellet kann stark variieren in Abhängigkeit von der Bodenart, von einer deutlich sichtbaren (~ 9 mm Durchmesser) kaum sichtbar. Es wird empfohlen, den Rückstand von Isopropylalkohol durch Absaugen an der Wand des Röhrchens vorsichtig, um nicht zum Saugen aus der DNA-Pellet entfernen. 20.a. Dry DNA-Pellet bei Raumtemperatur für 5 bis 20 min. Hinweis: Nicht über trockene DNA-Pellet, sonst wird es schwierig sein, die DNA wieder auflösen. 21.a. Resuspendieren DNA-Pellet in 200 ul TE. Mix it durch leichtes Klopfen. Übertragen Sie die DNA-Lösung in 1,5 ml-Tube. Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C über Nacht, um sich vollständig auflösen DNA. Hinweis: Je nach Größe der Pellets, können Sie die Lautstärke des TE passen hinzuzufügen. In der Regel 200 bis 400 ul TE funktioniert gut. * Alternativ folgen Sie den Schritten 15.b - 21.b. 15.b. Vorwäsche einer Amicon ® Ultra-15 Zentrifugalfilter Devices; 15 ml TE an das Gerät und Zentrifuge bei 3500 x g für 10 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. 16.b. Legen Sie die DNA-Lösung aus Schritt 13 an den pre-washed Amicon-Filter. Zentrifuge bei 3500 x g, bis die DNA auf 200 reduziert wird - 500 ul. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. 17.b. Waschen Sie die DNA mit TE zweimal, 10 ml TE zum Amicon-Filter-Geräte. Zentrifuge bei 3500 x g, bis die DNA-Menge auf etwa 200 ul reduziert wird. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen Sie noch einmal. 18.b. Übertragen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter in ein neues 1,5-ml-Tube. 19.b. Zugabe von 40 ul TE zum Amicon-Filter. Wash beiden Seiten der Filtermembranen durch Auf-und Abpipettieren, um etwaige DNA Rückstand auf dem Filter zu erholen. Fügen Sie diese Waschlösung auf das Rohr in Schritt 18.b. 20.b. Falls erforderlich, kann die DNA weiter konzentriert werden, indem Microcon ® Ultracel YM-30 Zentrifugalfilter Unit; Vorwäsche des Filters durch Zugabe von 200 ul TE und Zentrifugieren bei 10000 x g für 7 Minuten. Fügen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter und Zentrifuge bei 5000 x g für 1 min. Wiederholen Sie die Zentrifugation bis die Menge der DNA-Lösung auf dem Filter reduziert auf 50 ul rund. Hinweis: Der maximale Probenvolumen für Microcon Filter 500 ul. Nicht bei Geschwindigkeiten über 14000 x g. Zentrifuge Nicht über Zentrifuge, bis die Membran vollständig trocknet. Stellen Sie sicher, dass etwas Flüssigkeit bedeckt die Filter nach dem Zentrifugieren. Wenn Sie über zentrifugiert und die Membran trocken ist, fügen Sie dann 15 ul TE leicht bewegen für 30 Sekunden, und fahren Sie mit Schritt 21.b. 21.b. Platzieren Sie die Filtereinheit kopfüber in eine neue Microcon Rohr und Zentrifuge bei 1000 xg für 3 min, um die DNA zu erholen. 22. Quantifizierung der DNA durch TAE-Gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V für 4 Stunden) und durch Nanodrop Spektralphotometer oder Pico-Grün-Test und Platten-Lesegerät. Hinweis: DNA-Menge kann durch den Vergleich der Probe-Band um den Marker Band mit bekannter Konzentration (High molekulare DNA-Marker oder λHindIII) auf dem Gel abgeschätzt werden. 23. Überprüfen Sie die Integrität der DNA mit hohem Molekulargewicht mit Pulsed Field Gel-Elektrophorese (PFGE) mit 1%, 1xTAE Gel (Für weitere Details siehe Step II, part2 bei <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 durch Taupp et al 2009).. Hinweis: Sie können regelmäßig Agarosegel für diese QC Zweck anstelle von niedrig schmelzenden Agarose verwenden. Kurz gesagt, sind Elektrophorese-Bedingungen wie folgt: 2-250 kb, 6 Volt, erste Schaltzeit: 5 Sek., letzte Schaltzeit: 15 sec, für 12 Stunden bei 14 ° C betrieben SYBR Gold-Färbung für eine Stunde, um die DNA auf dem Gel sichtbar zu machen. 24. Wenn die Molekulargewichte der extrahierten DNA zufriedenstellend sind, dann an den folgenden CsCl-Gradienten Zentrifuge Schritt fort. Alternativ können DNA bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert werden, bevor die CsCl Zentrifuge. Die mittlere Größe der DNA sollte das gleiche sein oder mehr als 36 Kb, wenn Sie eine große einfügen metagenomische DNA-Bibliothek aufbauen wollen. Part II. DNA-Aufreinigung mittels Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation Vorbereitung der Zentrifuge: 1,5 - 2 Stunden Zentrifugationsschritt: 18 Stunden Entfernen Ethidiumbromid (EtBr) und die Konzentration DNA nach Zentrifugation: 3 Stunden Verfahren Weitere Informationen hierzu finden Wright et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Repräsentative Ergebnisse / Outcome Der Gesamtbetrag von genomischer DNA aus 2 g Waldboden organischen (O-Horizont) und mineralischen Horizonte (Ae, AB, und Bt-Horizonte) (abgetastet aus dem Long Term Soil Productivity (LTSP) Website unter Skulow See, BC, Kanada isoliert und wird von BC Ministry of Forests und Range) reichten von 10 mg bis 180 mg. Die mittlere Größe der isolierten DNA wurde in der Regel zwischen 40 bis 60 kb (Abbildung 1). Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm nm/280 wurde zwischen 1,3 bis 1,6, und es gab einen Peak bei 230 nm, die Huminsäure Kontamination oft in Bodenproben beobachtet hinweisen können. Die CsCl-Gradienten-Zentrifugation drastisch reduziert diese Verunreinigung und erhöhte auch das Verhältnis von 260/280 auf 1,8 bis 1,9, wie in Abbildung 2a und 2b gezeigt. <img src="files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. PFGE Bilder von der extrahierten genomischen DNA vor CsCl Ultrazentrifugation. lane1: 1 kb-Marker 100 ng, Spur 2: λHind III Marker 100 ng, Spur 3: λHind III Marker 250 ng, Spur 4: λHind III Marker 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb Marker 100 ng, Spur 6 und 7: genomische DNA aus dem Mineralboden Horizont Ae, Spur 8 und 9 isoliert: genomische DNA aus dem Mineralboden Horizont AB an der LTSP Website befindet Skulow See, BC isoliert <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" /> Abbildung 2. Chromograms von genomischer DNA von Spektralphotometer, bevor erkannt (A) und nach CsCl Ultrazentrifugation (B). Beachten Sie die Reduzierung der Extinktionswert bei der 230 nm Wellenlänge nach CsCl Ultrazentrifugation, die Verbesserung in der genomischen DNA Qualität zeigt. Bitte <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

<ol>
	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Rezept * Denaturierungslösung 4 M Guanidin-Isothiocyanat 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-Mercaptoethanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Denaturierenden Lösung: 10 ml in insgesamt </td></tr><tr><td> Guanidinisothiocyanat (MW 118,16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Fügen Sie Wasser auf 9,95 ml insgesamt. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Dann werden 50 ul 2-Mercaptoethanol kurz vor Gebrauch. (5 ul 2-Mercaptoethanol pro 1 ml Denaturierungslösung) Hinweis: Halten Sie die Denaturierung Lösung bei 4 ° C. Verwenden Sie keine Puffer älter als eine Woche. Wenn möglich, machen frischem Puffer zu verwenden. </td></tr></table> ** Extraktionspuffer 100 mM Natrium-Phosphat-Puffer [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M NaCl 1% Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Extraktionspuffer für 1 L in insgesamt </td></tr><tr><td> 1M Natrium-Phosphat-Puffer [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave und halten Sie sie bei Raumtemperatur. </td></tr><tr><td colspan="2"> Add 200 ml, 5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB, autoklaviert) und 100 ml, 20% SDS (autoklaviert) unmittelbar vor dem Gebrauch. Wenn CTAB wurde kristallisiert, schmilzt es bei 60 ° C. * 1M Natrium-Phosphat-Puffer: 57,7 ml, 1M Mononatriumphosphat (NaH 2 PO 4) und 42,3 ml, 1M Natrium dibasisch (NaH 2 PO 4). Der pH-Wert auf 7,0 Hinweis: Verwenden Sie keine 20% SDS, wenn es Niederschläge. Es ist normal, milchige Suspension sehen, wenn Sie SDS hinzu, um die Lösung. Sobald Sie fügen SDS, platzieren Sie den Extraktionspuffer bei 60 ° C, um sicherzustellen, SDS gut aufgehängt ist. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

Der Boden Mikrobiom ist ein riesiges und relativ unerforscht Reservoir von genomischer Diversität und metabolische Innovation, die eng mit Nährstoff-und Energieflüsse innerhalb terrestrische Ökosysteme verbunden ist. Anbau-unabhängigen Umweltgutachter genomische, auch als Metagenom bekannt, versprechen Ansätze beispiellosen Zugang zu diesen genetischen Informationen in Bezug auf Weg Wiederaufbau und funktionelles Screening für hochwertige therapeutische und Umwandlung von Biomasse-Prozesse. Doch der Boden Mikrobiom immer noch eine Herausforderung vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Beschaffung hochmolekulare DNA von ausreichender Qualität für große einfügen Bibliothek Produktion. Hier stellen wir ein Protokoll für die Gewinnung von hohem Molekulargewicht, mikrobiellen Gemeinschaft genomischer DNA aus Böden und Sedimenten. Die Qualität der isolierten genomischen DNA ist ideal für den Bau großer einfügen Umwelt genomische Bibliotheken für Downstream-Sequenzierung und Screening-Anwendungen. Das Verfahren beginnt mit Zell-Lyse. Zellwände und Membranen von Mikroben werden sowohl von mechanischen (Schleifen) und chemische Kräfte (β-Mercaptoethanol) lysiert. Genomic DNA wird dann isoliert mit Extraktionspuffer, Chloroform-Isoamylalkohol und Isopropylalkohol. Die Puffer für die Lyse und Extraktion Schritte eingesetzt werden, umfassen Guanidinisothiocyanat und Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB), um die Integrität der hochmolekularen genomische DNA zu erhalten. Abhängig von Ihrer nachgeschalteten Anwendung kann der isolierten genomischen DNA weiter aufgereinigt werden mit Cäsiumchlorid (CsCl)-Ultrazentrifugation, die Verunreinigungen einschließlich Huminsäuren reduziert. Das erste Verfahren, Extraktion, dauert ca. 8 Stunden, ohne DNA-Quantifizierung Schritt. Die CsCl Gradienten-Ultrazentrifugation, ist ein 2 Tage-Prozess. Während des gesamten Verfahrens, genomische DNA vorsichtig behandelt werden sollte, um Scherung zu verhindern, vermeiden Sie starke Verwirbelung und repetitive rauen Pipettieren.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments at JoVE.com

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Eine Methodik, um mit hohem Molekulargewicht und hoher Qualität genomischer DNA aus mikrobiellen Gemeinschaft zu isolieren beschrieben.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

extraction-high-molecular-weight-genomic-dna-from-soils

Research

JoVE Journal

Biology

25.5K Aufrufe.  University of British Columbia - UBC. Eine Methodik, um mit hohem Molekulargewicht und hoher Qualität genomischer DNA aus mikrobiellen Gemeinschaft zu isolieren beschrieben.

Serie: Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Eine praktische und neuartige Methode, um genomische DNA aus Blutentnahme Kits Auszug für Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

Modifizierte Methoden zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz reduzieren das Kontaminationspotenzial

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...