Wir sind dankbar, dass Samuel Shepard, Peter Bazeley und John David Bell für die Verwaltung des Genomic MRI Web-Seiten. Diese Arbeit wurde vom National Science Foundation Career Award &quot;Untersuchung der Introns zellulärer Funktionen&quot; unterstützt [Grantnummer MCB-0643542].

Alle verwendeten Programme in das Papier geschrieben wurden, die Perl-, und alle Web-Seiten wurden erstellt mit Hilfe von PHP. 1. Ausgangspunkt: Öffnen Sie die Startseite des Online-Genomic MRI-Paket an http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri /. Die Web-Ressource enthält auch Anweisungen / Erläuterungen zu den Programmen in der &quot;Hilfe (How-to/README)&quot;-Link, während alle veröffentlichten Materialien auf Genomic MRI und ähnliche Algorithmen in der &quot;Links zu relevanten Ressourcen&quot; aufgeführt Link. 2. Vorbereitung und Hochladen von Eingabesequenz (s). Erstellen Sie eine Datei mit FASTA-Format-Sequenz (en) zu einem GMRI Analyse-Sitzung zu starten. Jedes Nukleotid-Sequenz in diesem Format müssen mit einer einzigen Zeile, beginnend mit dem Zeichen &quot;&gt;&quot;, dass eine Kennung darstellt, auf der gleichen Linie durch eine kurze Beschreibung dieser Sequenz vorangestellt werden. Nukleotidsequenzen für GMRI Analyse erlaubt auch Zeichen wie R, Y, N, X, etc. Hwever, non-A, T, C, wird G-Zeichen vom Programm nicht verarbeitet werden und wird übersprungen. Sequenzen, in denen sich wiederholende Elemente wurden &quot;maskiert&quot; (ersetzt durch &quot;N&quot; s) als Eingang verwendet werden. Beachten Sie, dass Sequenz Zeichen Groß-und Kleinschreibung sind. <ol><li> Beginnen Sie ein GMRI Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;Start oder Fortsetzen&quot;-Taste auf der Genomic MRI-Homepage. Dies nimmt der Anwender auf eine Seite, wo Nukleotidsequenzen hochgeladen werden können. </li><li> Copy-and-paste Ihre FASTA-Format-Sequenzen oder laden Sie eine Datei mit den Sequenzen von Ihrem lokalen Rechner mit dem &quot;Datei auswählen&quot; klicken. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Neue Sitzung starten mit dieser Datei&quot;-Taste. Eine Bestätigung sollte über dem Eingabefenster die besagt, dass &quot;Ihre Reihenfolge wurde erfolgreich hochgeladen&quot; und sollten Sie auch eine alphanumerische &quot;GMRI Kennung&quot; [Die Website nennt es eine &quot;Session-label&quot;] für Ihre Sitzung (zB b16yMj), erscheinen die kann verwendet werden, um abrufen und weiterhin eine Sitzung für bis zu zwei Wochen nach der ersten Verwendung werden. </li></ol> HINWEIS: Von nun an den Eingang Sequenzen werden als &quot;userfile&quot; bezeichnet. 3. Holen Sie sich ein Oligonukleotid Häufigkeitsverteilung der Eingabesequenzen (optional). Klicken Sie auf das &quot;SRI Analyzer&quot;-Reiter (obere Reihe), um eine Verteilung von Oligonukleotid-Frequenzen für die gesamte Menge der Input-Sequenzen erhalten. Die Abkürzung SRI steht für die Kurzstrecken-Inhomogenität. An dieser Stelle kann der Benutzer angeben, die höchste Länge der Oligonukleotide (von 2 bis 9 Nukleotide, Standard 6 Nächte) für die Frequenzen berechnet werden. Diese Auswahl wird durch einen Klick auf die gewünschte Option im Rahmen des &quot;Maximum Oligomer size&quot; Listenfeld aus. Dann drücken Sie die &quot;Analyze File&quot;-Taste, um Rechenzeit zu initiieren. Eine grobe Darstellung der Input-Sequenz Zusammensetzung wird sofort als eine kurze Tabelle erscheinen in der Mitte dieser Web-Seite und zum Download als &quot;userfile.comp.tbl&quot;. Diese Tabelle stellt nur die meisten und am wenigsten reichlich Oligonukleotide innerhalb des Eingangs-Sequenzen. Die gesamte Frequenz-Tabelle für alle möglichen Oligonukleotiden als eine Datei namens &quot;userfile.comp&quot;, die über den &quot;Download Zusammensetzung file&quot; Link erreicht werden kann erzeugt werden. HINWEIS: SRI-Analysator zählt die gesamte Menge aller überlappenden Oligonukleotiden. 4. Generate Random-Sequenzen mit dem gleichen Oligonukleotid-Zusammensetzung wie in den Input-Sequenzen (optional). (Abschluss von Schritt 3 des Protokolls ist für diese Aufgabe erforderlich). <ol><li> Klicken Sie auf das &quot;SRI Generator&quot;-Reiter (obere Reihe) zu öffnen, eine neue Webseite, die zufälligen Sequenzen erzeugt. Wählen Sie die Anzahl der Proben von zufälligen Sequenzen generiert mit dem Listenfeld auf dieser Web-Seite sein. Jede dieser Probe Dateien zufälligen Sequenzen der gleichen Anzahl und Länge als Eingabe-Sequenzen in &quot;userfile&quot; enthalten. Außerdem, wenn eine Eingabe-Sequenz enthält non-A, T, C oder G-Zeichen, die zufälliger Reihenfolge wird &quot;N&quot; s genau den gleichen Positionen wie in der Eingangssequenz zu haben. </li><li> Wählen Sie die längste Länge der Oligonukleotide für die Frequenzen in der zufälligen Sequenzen angenähert werden. Dies kann durch die Überprüfung der Radio-Button für den gewünschten Oligomer Ebene (zB &quot;4-mers&quot; für Vier-Sockel-Oligonukleotide) in der Tabelle in der Mitte des Bildschirms ausgewählt werden. Es sei hier angemerkt werden, dass zufällige Sequenzen werden nicht nur die ungefähre Frequenzen bei der gewählten Oligomer Ebene, sondern auch die entsprechenden Frequenzen von kürzeren Oligomeren Ebenen, wie in der Input-Sequenzen bestehen. Kleine Schwankungen in der Oligonukleotid-Frequenzen von Eingangs-und zufälligen Sequenzen sind möglich aufgrund der Markov-Modell Verfahren für die Erzeugung von zufälligen Sequenzen angewendet. </li><li> Starten Sie das Programm, indem Sie auf &quot;Generate File&quot;-Taste. Wenn die Eingabe-Sequenzen groß sind kann es auch ein paar Minuten, um zufälligen Sequenzen zu erzeugen. So sollte ein Benutzer warten, bis die blaue &quot;Download&quot; links am unteren Rand der Seite erscheinen. Die zufällige Mengen werden in Dateien mit Namen wie &quot;userfile.randX_Y&quot;, wobei X die Anzahl der zufälligen Satz und Y ist die gewählte Oligomer Ebene (zB &quot;userfile_rand2_4&quot;) platziert. </li></ol> 5. Die Analyse der Mid-Range Inhomogenität (MRI) des Eingangs-und Zufalls-Sequenzen. <ol><li> Klicken Sie auf das &quot;MRI Analyzer&quot;-Reiter (obere Reihe), der sich öffnet, eine neue Web-Seite, die Mid-Range-Inhomogenität der Nukleotid-Zusammensetzung von Sequenzen analysiert. </li><li> Wählen Sie eine Sequenz aus dem analysiert werden Listenfeld (eine Auswahl zwischen den Eingangs-Sequenz und generiert Sätze von zufälligen Sequenzen können hier gemacht werden) &quot;File zu analysieren.&quot; </li><li> Wählen Sie die Art des Inhalts der MRT über den vorgesehenen Listenfeld analysiert werden. (Seven Content-Optionen sind verfügbar: G + C, G + A, G + T, A, G, C oder T.) </li><li> Wählen Sie die Länge des Fensters für die inhaltsreiche und Content-poor-Sequenzen über das &quot;Window size&quot; Listenfeld (Standard ist 50 Nukleotide, die gültige Bereich liegt zwischen 30 bis 1000) untersucht werden. </li><li> Wählen Sie die obere Schwelle und unterer Schwelle für inhaltsreiche und Content-armen Regionen bzw.. Diese Schwellenwerte können durch die genaue Anzahl der bestimmte Nukleotide in das aktuelle Fenster (mit dem nach Anzahl Option im Listenfeld) oder durch Prozentsatz dieser Nukleotide in das Fenster definiert werden (mit dem prozentual Option) </li><li> Nachdem alle fünf Entscheidungen getroffen wurden (zum Beispiel: Sequence = &quot;userfile&quot;; Content = GC; Fenstergröße = 50; Obere Schwelle = 35; Untere Schwelle = 15), rufen Sie das Programm, indem Sie die Datei analysieren Taste. Das Programm durchsucht alle Sequenzen aus dem gewählten Eingang nacheinander. Bei jedem Schritt erhält es ein Segment der aktuellen Sequenz mit einer Länge gleich dem angegebenen Fenstergröße und berechnet, ob die Anzahl oder den Prozentsatz von Nukleotiden der gewählten Inhalt über dem oberen Schwellenwert oder unter dem unteren Grenzwert liegt. Wenn das Fenster nicht zutrifft Kriterien, wird die nächste überlappende Fenster (verschoben um ein Nukleotid) für die gleiche Analyse ausgewählt. Wenn ein Fenster zu finden ist, wo die Sequenz trifft man auf der Schwelle für Content-reich oder arm-Zusammensetzung, speichert das Programm die Reihenfolge der Fenster in der Ausgabe-Datei und erzeugt einen Spike auf die grafische Ausgabe. Danach springt das Programm auf den nächsten nicht-überlappenden benachbarten Fenster und setzt den Scan-Vorgang bis zum Ende der Sequenz erreicht ist. </li><li> Nach Abschluss des Programms, erscheint ein Link, um die Ausgabe-Datei (mit dem Namen &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; für das Beispiel oben) und eine grafische Darstellung der Ergebnisse ist in der Mitte der Web-Seite angezeigt (siehe Abbildung 1). Auf dieser grafischen Darstellung aller Input-Sequenzen aus dem userfile sind in einer einzigen Zeichenfolge verkettet und als eine horizontale schwarze Linie auf der X-Achse, mit der Länge in Kilobasen (kb) unten gezeigt. Alle Inhalte reichen Regionen entlang Eingang Sequenzen sind so blau &quot;nach oben&quot; Spikes und Content-armen Regionen als rot &quot;nach unten&quot; Spikes markiert. Die Gesamtzahl der inhaltsreichen und Content-poor-Fenster sind in parenthses in der Legende am unteren Rand dieser Zahl (32 bzw. 19) dargestellt. Die Abbildung dient dazu, die relative Häufigkeit und die Anordnung der MRI Regionen zu veranschaulichen. In der Zwischenzeit spezifische Details werden in der Ausgabedatei (siehe Abbildung 3) vorgestellt. In dieser Datei sind alle Nukleotidsequenz Segmente, die Content-reich oder arm-Kriterien und deren Koordinaten entsprechen einem Benutzer zur Verfügung, wie eine Liste nach ihren aufeinanderfolgenden Positionen entlang der Eingabedatei. </li><li> Nach Abschluss der MRI-Analyse für die gesuchte Sequenz kann ein Benutzer ein neues Verfahren in der Web-Seite zu starten, indem Sie Änderungen von Parametern und / oder Eingabe-Dateien. Zum Beispiel, um die zuvor generierten Stichprobe Nr. 1 mit der gleichen MRT-Parameter zu untersuchen, der Benutzer muss nur die Datei ändern, um Option zu analysieren und die Option &quot;userfile_rand1_4&quot;-Datei, und drücken Sie dann die Datei analysieren Taste erneut. Eine neue Datei und grafische Darstellung wird die alte ersetzen. Die Ergebnisse und Zahlen aller Untersuchungen unter jeder &quot;Sitzung Label&quot; (GMRI Identifier) ​​werden gespeichert und stehen für zwei Wochen aus der letzten Aktivität. Um die Ergebnisse speichern / Bildnahmen permanent, sollte der Benutzer wählen Sie den &quot;Download Dateien&quot; (obere Reihe) und laden Sie die gesamte Sitzung oder einzelne Dateien, wie gebraucht. </li><li> Mit dieser MRI Analyzer Web-Seite kann ein Benutzer-Studie <ul><li> (G + C)-reiche und (A + T)-reichen Regionen </li><li> Purin-(A + G)-reiche und Pyrimidin (C + T)-reichen Regionen </li><li> Keto (G + T)-reiche und Aminosäuren (A + C)-reichen Regionen </li><li> A-reiche und A-armen Regionen </li><li> G-reiche und G-armen Regionen </li><li> T-reich und T-armen Regionen </li><li> C-reiche und C-armen Regionen </li></ul></li><li> Die neueste Version von Genomic MRI hat eine neue Option für das Studium Regionen reich an Purin (R) / Pyrimidin-(Y) Wechsel Muster, die Z-DNA Konformation bilden könnten. Derzeit ist diese Option zur Verfügung unter dem Link &quot;Z-DNA&quot; und es funktioniert auf der gleichen Grundlage wie die anderen erwähnten MRI Regionen. Ein Anwender muss zuerst obere und untere Schwellenwerte für die Anzahl der (RY + YR) überlappenden Dinukleotide in der Scan-Fenster. Das Programm erzeugt eine ähnliche grafische Ausgabe und eine Datei von DNA-Segmenten bereichert und durch abwechselnde Purine und Pyrimidine erschöpft. Der vermeintliche Z-DNA-Regionen müssen stark von wechselnden R / Y-Basen angereichert werden (siehe Review F &amp; F 2011). </li></ol> 6. Zusätzliche Programme innerhalb der genomischen MRI-Paket (optional). Das Genomic MRI Ressource hat auch zwei erweiterte Optionen für die Erzeugung von sehr spezifischen zufälligen Sequenzen. Sie sind durch das &quot;MRI Generator&quot; und &quot;CDS Generator&quot; Registerkarten in der oberen Reihe zur Verfügung. <ol><li> MRI-Generator erstellt randomisierten Sequenzen mit dem gleichen Oligonukleotid Zusammensetzung wie die Eingabedatei (ähnlich wie SRI-Generator). Doch darüber hinaus imitieren randomisierten Sequenzen einer bestimmten MRI-Muster durch den Anwender vorgegeben. Innerhalb dieser Web-Seite eines Benutzers sollte aus einem Listenfeld einen besonderen MRI Muster nachgeahmt werden. Die Liste enthält alle Muster, die in dieser Sitzung wurden von MRI-Analysator (zB &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;) untersucht. Ein zufälliger Reihenfolge mit dieser Option generiert haben die gleiche Zusammensetzung wie das Oligonukleotid ausgewählt Eingabedatei und auch die gleiche GC-reich und die Armen Muster wie in &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; gesehen. </li><li> CDS-Generator ist für die Randomisierung von Protein kodierenden Sequenzen verwendet. Es bewahrt die gleiche Aminosäuresequenz wie das von den vom Benutzer angegebenen Eingang codiert. Neben dem Programm bleibt die gleiche Codon und di-Codon Verzerrungen, wie in der vom Benutzer gewählten Eingang Tabelle angegeben. Die Online-Version des CDS-Generator akzeptiert auch eine Proteinsequenz als Eingang. Alle anderen Optionen für das Programm sind nur über Stand-alone-Perl-Skripte zum Download zur Verfügung von der Hauptstraße Genomic MRI Webseite angeboten. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Dieses Protokoll ermöglicht es einem Benutzer, kompositorische Inhomogenität der Nukleotid-Sequenzen zu untersuchen. Wichtig ist, es unterstützt auch die Erzeugung einer Vielzahl von randomisierten Sequenzen mit einem Oligonucleotid Zusammensetzung annähert, dass der Eingangs-Sequenzen. In der Regel werden genomischen Sequenzen von komplexen Eukaryonten nicht in der Zusammensetzung homogen, sondern bilden vielmehr ein komplexes Mosaik aus Sequenzabschnitte durch bestimmte Nukleotide angereichert (z. B. Purin-reiche, (G + T)-reiche, (A + T)-reiche, etc.). Diese Muster bei Mid-Range-Skala (3-10 bp) visualisiert werden durch die grafische Ausgabe des MRI-Analyzer, inhaltsreichen Segmente ausgewählt zeigt als obere blaue Spitzen-und Content-armer als untere rote Spitzen (siehe Abbildungen 1 und 2). Typischerweise ist die Anzahl der Inhalte-reich und content-armen Regionen in einer natürlichen Reihenfolge (Abbildung 1) in der Größenordnung von Mal höher als die Zahl der die gleichen Typen von Regionen in entsprechenden randomisierten Sequenzen (Abbildung 2) mit dem gleichen Oligonukleotid Zusammensetzung. Diese Sequenzabschnitte mit Mid-Range-Inhomogenität in Nukleotid-Zusammensetzung kann von Interesse für den Benutzer sein. Sie sind aus dem Genomic MRI Ausgabedateien für weitere Untersuchungen. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein Beispiel für die MRI-Analysator grafische Ausgabe von Schritt 5.7. Die Ergebnisse wurden anhand einer Stichprobe von 44 menschlichen Introns erhalten worden. Blaue Balken repräsentieren Positionen der GC-reichen Regionen entlang dieser Introns. Rote Balken repräsentieren GC-armen (oder AT-reiche) MRI Regionen. Die y-Achse enthält obere und untere Grenzwerte für die gegebene Art des Inhalts. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. MRI-Analysator-Ausgang für den zufälligen Sequenz &quot;userfile.rand1_4&quot;. Die grafischecal Darstellung der MRI innerhalb einer zufällig generierten Sequenz mit dem SRI-Generator Programm. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ein Beispiel für den Beginn einer Textausgabe Datei von MRI-Analysator. Alle Content-reiche und die Inhalte der Armen-Sequenzen durch das Programm erkannt werden in der letzten (vierten) Spalte dargestellt. Ihre relativen Positionen, in die Anzahl der Fenster gemessen werden, sind in der ersten Spalte angezeigt. Die zweiten und dritten Spalte sind Indikatoren für Content-reiche und Content-armen Regionen bzw..

<ol>
	<li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures.">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li><li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales.">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li><li>Fedorov, A., Fedorova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+An+Intricate+Mosaic+of+Genomic+Patterns+at+Mid-range+Scale.">Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale.</a> Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).</li><li>Shepard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+Binary-abstracted+Markov+models+and+their+application+to+sequence+classificatio.">Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio.</a> The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , 57-157 (2010).</li></ol>

Regionen mit inhomogener Nukleotid-Zusammensetzung bei Mid-Range-Skalen (3-10 Nukleotide) sind überreich in den Genomen von komplexen Eukaryonten und kann überall gefunden werden (intergenischen Regionen, Introns, untranslatierten Regionen der Exons, repetitive Elemente). Diese Regionen sind häufig mit ungewöhnlichen DNA-Konformationen zugeordnet. Zum Beispiel neigen purine-/pyrimidine-rich Sequenzen DNA Triplexen (H-DNA) bilden; Sequenzen mit alternierenden Purin / Pyrimidin-Basen sind mit Z-DNA Konformation verbunden sind; (G + C)-reichen Regionen weisen strukturelle Anomalien in B- DNA und könnte anfällig für Backbone-Spaltung; (A + T)-reiche Regionen bilden könnte eine ungewöhnliche Struktur - eine DNA Abwickeln Element; etc. (Bewertung von Fedorov &amp; Fedorova 2010). Einige dieser Mid-Range-Mustern (zB (G + T)-reiche Regionen) sind kaum untersucht und warten noch auf gründliche Erforschung und Anerkennung. Das Hauptziel unserer Genomic MRI Web-Ressource für Benutzer in der Identifizierung dieser MRI Regionen für ihre weitere experimentelle Analyse und für die Erforschung ihrer möglichen Funktionen helfen. Die Kenntnis der MRI Regionen könnten in einbezogen werden und zur Verbesserung der neuen Generation von Gen-Vorhersage-Programmen (Shepard 2010) und unser Verständnis des Genoms Funktionen und Eigenschaften.

<ul><li> Computer mit Internet </li><li> Dateien mit Nukleotidsequenzen zur Prüfung. </li></ul>

genomic mri - a public resource for studying sequence patterns within genomic dna

Nicht-codierende genomische Regionen in komplexen Eukaryonten, einschließlich intergenischen Bereichen, Introns und nicht übersetzte Segmente des Exons, sind zutiefst nicht-zufällige in ihrer Nukleotid-Zusammensetzung und bestehen aus einem komplexen Mosaik von Sequenz-Muster. Diese Muster sind so genannte Mid-Range Inhomogenität (MRI)-Regionen - Sequenzen 3-10 Nukleotiden Länge, die von einer bestimmten Basis oder eine Kombination von Basen angereichert sind (z. B. (G + T)-reiche, Purin-reiche, etc. ). MRI Regionen mit ungewöhnlichen (non-B-Form) DNA-Strukturen, die oft in der Regulation der Genexpression, Rekombination und andere genetische Prozesse (Fedorova &amp; Fedorov 2010) beteiligt sind, verbunden. Die Existenz einer starken Fixierung Bias innerhalb MRI Regionen gegen Mutationen, die zur Verringerung ihrer Reihenfolge Inhomogenität unterstützt zusätzlich die Funktionalität und die Bedeutung dieser genomischen Sequenzen (Prakash et al. 2009) neigen. Hier zeigen wir eine frei verfügbare Internet-Ressource - die Genomic MRI-Programm-Paket - (. Bechtel et al 2008) für computergestützte Analyse von genomischen Sequenzen entworfen, um zu finden und zu charakterisieren verschiedene MRT-Muster in ihnen. Dieses Paket erlaubt die Erzeugung von randomisierten Sequenzen mit verschiedenen Eigenschaften und das Niveau der Korrespondenz, die die natürliche Eingabe-DNA-Sequenzen. Das Hauptziel dieser Ressource ist, die Prüfung der weiten Gebieten der nicht-kodierenden DNA, die noch kaum erforscht und warten auf gründliche Erforschung und Anerkennung zu erleichtern.

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Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Wir präsentieren eine öffentliche Computational Website für die Analyse von genomischen Sequenzen. Es erkennt DNA-Sequenz-Muster mit verschiedenen nicht-zufällige Nukleotid Kompositionen. Diese Ressource erzeugt auch randomisierte Sequenzen mit verschiedenen Ebenen der Komplexität.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Aufrufe.  University of Toledo Health Science Campus. Wir präsentieren eine öffentliche Computational Website für die Analyse von genomischen Sequenzen. Es erkennt DNA-Sequenz-Muster mit verschiedenen nicht-zufällige Nukleotid Kompositionen. Diese Ressource erzeugt auch randomisierte Sequenzen mit verschiedenen Ebenen der Komplexität.

Serie: Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Eine praktische und neuartige Methode, um genomische DNA aus Blutentnahme Kits Auszug für Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.