<html> Hier diskutieren wir die experimentellen Verfahren, die in LUCAS [1-3] beteiligt sind. Zur Veranschaulichung der Proof of Concept von LUCAS beschreiben wir die bildgebenden Verfahren für eine ganze Blutprobe. A. Imaging Set-up Die LUCAS Imaging-Plattform weist signifikante Vorteile auf eine kostengünstige und kompakte Alternative zu den bestehenden Point-of-care-Zytometrie und medizinische Diagnose-Tools bieten, vor allem für mit beschränkten Ressourcen. Anstatt erkennen das Bild der Zellen, LUCAS statt erfasst digitale Hologramme der Zellen, die durch die Interferenz des gestreuten Lichtes von jeder Zelle mit dem Hintergrund Licht erzeugt werden. Sorgfältige Kontrolle der partiellen räumlichen Kohärenz der Beleuchtung ist entscheidend für die holographische Aufzeichnung zu ermöglichen. 1. Digitale Sensor-Array Die LUCAS-Plattform nutzt einen optoelektronischen Sensor-Array digital aufzuzeichnen einzelne Zelle Hologramme. Zu diesem Zweck berechnet paar Geräte (CCD; Beispiel Models: KAI-11002, KAF-39000, von Kodak) oder komplementäre Metall-Oxid-Halbleiter-Chips (CMOS, Sample Model: MT9P031, Micron) verwendet werden kann. Pixel Größen für die Kodak berechnet paar Geräte, KAI-11002, KAF-39000 und Micron CMOS Bildsensoren sind 9 um, 6,8 um und 2,2 um, mit einer aktiven FOV von 10 cm2, 18 cm2, und 24,4 mm2 bzw.. [1-2]. 2. Light Source Anders als die meisten anderen mikroskopischen bildgebenden Verfahren nicht LUCAS nicht braucht einen Laser und damit auch eine einfache Leuchtdiode (LED) können für die Beleuchtung verwendet werden. Um abstimmbare Wellenlänge Beleuchtung ermöglichen, können wir auch nutzen, einen Monochromator mit einer Xenon-Lampe (Cornerstone T260, Newport Corp) zusammen mit einem Standard-Fused Silica-Faser, die aus einem Bündel von Fasern (77564, Newport) und Lochkamera der aus ~ 100 pm Durchmesser bei ~ 5-10 cm über der Sensoroberfläche befinden. Das abstimmbare Wellenlänge Beleuchtung Konfiguration bietet eine flexible Plattform, wo die holographische Unterschriften der Zellen angepasst werden können, und hybride digitale Signaturen können synthetisiert werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern für eine bessere Charakterisierung Genauigkeit und Spezifität werden. [3] B. Probenvorbereitung und Imaging Ein Proof of Concept von LUCAS On-Chip-Bildgebung demonstriert mit einer heterogenen Lösung wie unten beschrieben werden. Ein ähnliches Protokoll könnte für verschiedene andere Zelltypen [1-3] angewendet werden. 1. Vollblut Verdünnung und Aufbereitung der heterogenen Lösung <ol><li> Zu Beginn des Prozesses, erhalten eine Vollblutprobe und Polystyrol Mikroperlen mit verschiedenen Durchmessern (5, 10 und 20 um. Duke Scientific), und bringen sie alle auf Raumtemperatur. </li><li> Geben Sie 2 ml RPMI 1640 classic flüssigen Medien (Fisher Scientific) als Verdünnungsmittel in eine sterile 5 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> Nach Inkubation der Vollblutprobe für 30 Minuten, Pipette bis 10 l sedimentierten Erythrozyten Probe und wird in das RPMI-Lösung. </li><li> Fügen Sie ein Gesamtvolumen von 20 ul Polystyrol Mikroperlen in Erythrozyten RPMI verdünnt, und bewegen Sie die Zell-Lösung durch vorsichtiges Pipettieren oder durch Magnetrührer mit einem Rührstab. </li><li> Legen Sie ein Gesamtvolumen von 5-15 ul heterogene Lösung auf ein Deckglas und legen Sie eine zweite, identische Deckglas über die Lösung mit Hilfe einer Pinzette. Die Probe sollte zwischen den beiden Deckgläschen gleichmäßig angeordnet sein. </li><li> Dann, mit einem Vakuum-Pen (NT57-636, Edmund Optics) laden Sie die Probe auf den aktiven Bereich des Sensor-Arrays für die Bildgebung. </li></ol> 2. Vollblut-Färbung <ol><li> Beginnend mit der Herstellung eines Gemisches von 0,1% gepuffert Eosin Y und verwässert New Methylenblau-Lösung mit Power-Typ reine Eosin Y (MW = 691,85, Acros Organics), Zink-free pure New Methylenblau-Farbstoff (MW = 347,90, Acros Organics), und Kaliumoxalat-Monohydrat (99,0% Reagent ACS, Acros Organics); jede Lösung ist mit einem 0,45 um Porengröße Syringless Filter (Whatman) für wässrige weißen Blutkörperchen Färbung gereinigt. </li><li> Dann vorsichtig umrühren gelöster wässriger Färbereagenz mit der Vollblutprobe in einem Volumenverhältnis von 1:1 in einem Polypropylen-Becher mit einem Magnetrührer für 2 Minuten und 10 Minuten inkubieren. </li><li> Übertragen einer gefärbten Blut Lösung von 50 ul in eine 5 ml Polypropylen-Röhrchen und verdünnt mit RPMI 1640 classic flüssigen Lösung (Fisher Scientific) von 1,95 ml bis zu einem Volumen-Verhältnis von 1:200 zu erwerben. Dann Wirbel der Verdünnung für 30 Sekunden. Eine andere Verdünnung können auch in dieser Phase eingeführt werden. </li><li> Pipettiere gefärbte Zelle Lösung von 10-100 ul zwischen Deckgläschen oder innerhalb eines mikrofluidischen Reservoir. Dann, mit einem Vakuum-Pen (NT57-636, Edmund Optics), legen Sie die Probe auf den aktiven Bereich des Sensor-Array. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /> Abbildung 1: LUCAS ermöglicht eine genaue Zählung und digitale Differenzierung der verschiedenen Zellen und Mikro-Objekte auf ihre 2D-Hologramm-Signaturen ohne Verwendung von Kontaktlinsen, Laser oder andere sperrige optische Komponenten. Charakteristisch LUCAS Unterschriften von verschiedenen Mikro-Objekte sind in dieser Abbildung dargestellt und werden gegen einen herkömmlichen Mikroskop-Bild mit einer 40X Objektiv verglichen. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1650/1650Fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: (links) Raw Bild einer heterogenen Mischung, die roten Blutkörperchen, 10um, 5um und 3 um Partikel. (Rechts) Vollautomatische LUCAS Charakterisierung Ergebnisse für das gleiche Sichtfeld dargestellt. Beachten Sie, dass die Entscheidungs-Algorithmus robust bei der Charakterisierung von Regionen hoher Dichte sowie Partikel mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis wie die 3um Perlen ist. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" border="0" /> Abbildung 3: Die LUCAS benutzerdefinierte Schnittstelle dargestellt. Java-basierte Software ermöglicht LUCAS-Eingänge für verschiedene experimentelle Bedingungen wie der Sensor Pixelgröße oder die Wellenlänge des Lichts. Die Auswahl eines spezifischen Gebiet der Blick auf das Bild kann auch gemacht werden und die Zielzelle Muster kann vom Benutzer definiert werden, um eine statistische Zelle Schatten Bibliothek zu bauen. Die erworbenen LUCAS Bild kann dann auf Basis dieses Trainings-Daten (dh, die Zelle Schatten Bibliothek) und die markierte (gezählt) Bild wird dem Benutzer angezeigt charakterisiert werden. Statistik des Grafen Ergebnisse werden auch als XML-Datei zur weiteren Analyse gespeichert.

<ol>
	<li>Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Lensfree+Holographic+Imaging+for+On-Chip+Cytometry+and+Diagnostics".">"Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics".</a> Lab Chip. , (2009).</li><li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="High-throughput+Imaging+and+Characterization+of+a+Heterogeneous+Cell+Solution+on+a+Chip"+.">"High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" .</a> Biotechnology and Bioengineering. , (2008).</li><li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Multi-color+LUCAS:+Lensfree+on-chip+cytometry+using+tunable+monochromatic+illumination+and+digital+noise+reduction".">"Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction".</a> Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).</li></ol>

Wir haben gezeigt, dass die LUCAS-Plattform kann genau zu zählen und zu identifizieren verschiedenen micro-objects/cells auf einem Chip auf ihre holographischen Signaturen basieren, und bietet ein vielversprechendes Werkzeug für Point-of-care Diagnostik und High-Throughput-Zell-Biologie. Zur genauen Prozess der aufgezeichneten holographischen Mustern, haben wir ein individuell entwickelte LUCAS Entscheidungs-Software. Dieser Algorithmus, der eine statistische Beugungsbild Datenbank durch die Ausbildung von LUCAS Bilde...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Charged couple device (CCD)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KODAK</td>
<td>KAI-11002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Charged couple device (CCD)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KODAK</td>
<td>KAF-39000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micron</td>
<td>MT9P031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenon Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport Corp.</td>
<td>Cornerstone T260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edmund Optics</td>
<td>NT57-636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5, 10, and 20 &mu;m Microbeads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>4000 Series</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pure Eosin Y</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>MW=691.85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Methylene Blue(NMB) Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>MW=347.90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Oxalate Monohydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>99.0% Reagent ACS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

lensless on-chip imaging of cells provides a new tool for high-throughput cell-biology and medical diagnostics

Herkömmliche optische Mikroskope Bildzellen durch die Verwendung von Objektiven, die zusammen mit anderen Objektiven und optischen Komponenten. Während sehr effektiv, hat diese klassische Vorgehensweise bestimmte Einschränkungen für die Miniaturisierung der Imaging-Plattform kompatibel zu machen mit den fortgeschrittenen Stand der Technik in der Mikrofluidik. In diesem Bericht stellen wir experimentelle Details eines ohne Linsen auskommt, On-Chip-Imaging-Konzept bezeichnet LUCAS (<strong<em&gt; L</em</strong&gt; Ensless<strong<em&gt; U</em</strong&gt; LTRA-weites Feld-of-view<strong<em&gt; C</em</strong&gt; Ell Überwachung<strong<em&gt; A</em</strong&gt; Rray Plattform basierend auf<strong<em&gt; S</em</strong&gt; Hadow imaging), die benötigt keine Mikroskop-Objektive oder andere sperrige optische Komponenten zum Bild einer heterogenen Zell-Lösung über einen extrem weiten Bereich der Ansicht, dass span so groß wie kann ~ 18 cm<sup&gt; 2</sup&gt;. Darüber hinaus, im Gegensatz zu herkömmlichen Mikroskopen können LUCAS Bild einer heterogenen Zell-Lösung von Interesse über eine Tiefe-of-Bereich ~ 5 mm, ohne die Notwendigkeit für eine Neuausrichtung, die bis ~ 9 mL Probenvolumen entspricht. Das Imaging-Plattform zeichnet die Schatten (dh ohne Linsen auskommt, digitale Hologramme) jeder Zelle von Interesse in seinem Blickfeld, und automatisierte digitale Verarbeitung dieser Zelle Schatten kann der Typ, der Graf und die relativen Positionen von Zellen in der Lösung zu bestimmen. Weil es erfordert kein sperriges optischen Komponenten oder mechanischen Scanningtische bietet es eine deutlich miniaturisierte Plattform, die gleichzeitig reduziert die Kosten, die ganz wichtig ist vor allem Point of Care Diagnostik. Darüber hinaus ist die Bildgebung Durchsatz von dieser Plattform Größenordnungen besser als bei herkömmlichen optischen Mikroskopen, die als überaus wertvoll für die Hochdurchsatz-Zell-Biologie Experimente könnten.

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Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Lensfree On-Chip-Bildgebung und Charakterisierung von Zellen dargestellt. Diese On-Chip-Cell-Imaging-Ansatz bietet eine kompakte und kostengünstige Tool für die medizinische Diagnostik und High-Throughput-Zellbiologie-Anwendungen, so dass es besonders geeignet für arm an Ressourcen-Einstellungen.

Ohne Linsen auskommt, On-Chip-Bildgebung von Zellen hat ein neues Instrument für High-Throughput-Zell-Biologie und der medizinischen Diagnostik

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

lensless-on-chip-imaging-cells-provides-new-tool-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Lensfree On-Chip-Bildgebung und Charakterisierung von Zellen dargestellt. Diese On-Chip-Cell-Imaging-Ansatz bietet eine kompakte und kostengünstige Tool für die medizinische Diagnostik und High-Throughput-Zellbiologie-Anwendungen, so dass es besonders geeignet für arm an Ressourcen-Einstellungen.