Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council Linkage Infrastructure Equipment und Facilities Grant LEO668421 und Australian Research Council Linkage Project Grant LP0669471 unterstützt. Die Autoren bedanken sich für die Zusammenarbeit von Kanazawa Institute of Technology und Yokogawa Electric Corporation in die Gründung der KIT-Macquarie Hirnforschung Laboratory.

Diese Richtlinien beschreiben Geräte und Verfahren zur Messung der kognitiven Funktion des Gehirns bei Vorschulkindern mit Magnetenzephalographie (MEG). Zuerst diskutieren wir die allgemeinen Leitlinien und Fragen, die bei der Durchführung experimenteller Untersuchungen der kognitiven Funktion bei Kindern werden müssen. Zweitens beschreiben wir ein Protokoll entwickelt, um die Anforderungen der MEG Datenerhebung mit dem Motivations-und Verhaltens-Kapazitäten von vier-jährige Kinder auszurichten. 1. Allgemeine Überlegungen zur Untersuchung von Kindern mit MEG MEG-Forscher mit einer Reihe von einzigartigen Herausforderungen bei der Arbeit mit wach gesunde Kinder. Zunächst wird ein starker und funktionelle Laborumgebung wahrscheinlich einschüchtern oder ängstigen kleinen Kindern. Zweitens sind die grundlegenden Anforderungen an eine experimentelle MEG Studie Einschränkung der Bewegungsfreiheit und aktiv teilnehmen, um eine Aufgabe für einen längeren Zeitraum, Bedingungen, dass viele Erwachsene mühsam und unbequem zu finden. Bei der Untersuchung von Kindern wird es unumgänglich, die experimentellen Verfahren, um die Fähigkeiten und Grenzen der Kinder anzupassen. In diesem Abschnitt beschreiben wir die ersten Schritte bei der Vorbereitung der Gegenstand in ein Datenerfassungssystem Sitzung teilnehmen wollen. 1,1 Einarbeitung / Training Session: Für Kinder im Vorschulalter eine Einarbeitung / Schulung wird vor der eigentlichen Datenerfassung Sitzung geplant. Diese Sitzung ermöglicht dem Kind, sich mit der Umwelt und die Forscher in ihrem eigenen Tempo. Wir stellen das Kind und die Eltern auf die Forscher und machen sie mit dem Labor Umgebung und Routinen. Bis zum Ende der Einführungsveranstaltung der Eltern und Kind verstehen, alle Schritte in teilnehmenden beteiligt und verstehen, was sie sollte während der Datenerfassung zu erwarten. Wenn beim ersten Besuch, erscheint ein Kind schüchtern oder ängstlich, haben wir einen Zeitraum von Spielzeit, bis sie sich wohler fühlen. Dann haben wir mit der Einführung der alle Schritte gehen. 1,2 erklären die Umwelt: Um die MEG-Umgebung für das Kind zu erklären, setzen wir ein Thema, das kindgerecht Rechtfertigung für die Umgebung bietet. Zum Beispiel ist die MEG-System ein Raumschiff wartet auf die Kinder auf ein Abenteuer im Weltraum, wo einige ungewohnte Ereignisse auftreten zu nehmen. Das Labor hat auch mit Wandtattoos und Spielzeug (Abb. 1) eingerichtet, und es hat einen eigenen Spielraum. Beim Gespräch mit dem Kind, verwenden wir Sprache, die Kinder können einfach wie &quot;Einfrieren&quot; anstelle von &quot;Minimierung Bewegung&quot; und &quot;Astronaut Helm &#39;anstelle von&#39; Marker-Coil-cap &#39;zu verstehen. 1,3 Erläuterung der Verfahren für das Kind und den Eltern: Wir zeigen dem Kind und dem Elternteil die Schritte, die ergriffen werden, bevor das Kind geht in die magnetisch abgeschirmten Raum (MSR) sind. Einer der ersten Schritte ist es, ein Fünf-Marker-Coil-Mütze auf den Kopf des passen; diese Spulen zeigen die Position des Motivs den Kopf in den MEG Helm. Mit dem Kind helfen, digitalisieren wir die Kopfform eine Marionette, und dann laden wir dem Kind und dem Elternteil, der Puppe, die MSR / Raumschiff begleiten. Einmal in der MSR, legen wir die Puppe den Kopf im Helm, um einen Film zu sehen. Dann bitten wir das Kind, wenn sie den Film mit der Puppe sehen wollen. Wenn das Kind bequem und entspannt und ihre Eltern mit unseren Protokollen zufrieden, laden wir sie zu einem Spiel in dem Raumschiff spielen sie das nächste Mal besuchen Sie unsere Labor. 1,4 Workbooks: Wir haben Arbeitsmappen auf dem Weltraumabenteuer Thema, das die Schritte Kinder während der Test-Session dauern wird zeigt basiert. Kinder sind diese worksbooks gegeben mit nach Hause nehmen und die Arbeit durch sie mit ihren Eltern in der Vorbereitung für den nächsten Besuch. Das Ziel der Arbeitsmappen ist es, die Bedeutung der drei wichtigsten Anforderungen für die Prüfung zu betonen: a) die Vermeidung von Eisen-Material im Inneren des MSR, b) die Platzierung von Marker-Spule Kappe, genaue Daten Co-Registrierung und c zu gewährleisten) und die Bedeutung der restlichen noch während der Digitalisierung und Datenerfassung. 2. Ein Verfahren zur Messung der MEG-Signale von pre-Kinder im Grundschulalter 2,1 Ausstattung während der Datenerfassung und experimentelle Aufgabe eingesetzt Marker-Coil-Kappe: Um MEG-Daten mit dem Thema der strukturellen Informationen (zB MRI oder digitalisierte Kopfform), ein Satz von fünf Spulen auszurichten sind in eine Badekappe, die das Kind trägt in der MEG Helm gelegt. Diese Spulen dienen als Bezugspunkte und ihre Positionen sind vor und nach der Aufgabe zu messen, wie viel den Kopf des bei der Akquisition verschoben wurde verglichen. Digitizer: Vor Datenerfassung, die Position von fünf Marker Spulen und die Kopfform des Themas wird digitalisiert mit einer Polhemus Fastrak ® Digitizer (Colchester, VT). Der Digitizer besteht aus einem Stift Digitalisierer, drei Empfänger, einem Sender und einem Motion-Tracking-Einheit. Dieser Prozess misst die Lage der Spulen. Später wurden diese Standorte sind gegen die Standortinformationen von MEG erhalten, die erworbenen magnetischen Daten-und Kopfform anzupassen abgestimmt. Child MEG-System: Die Datenerfassung erfolgt mit Hilfe eines Ganzkörper-Kopf Kind MEG-System (KIT, Kanazawa, Japan) [2]. Die Daten werden kontinuierlich mit einer Abtastrate von 1000 Hz erfasst, mit einem Online-Bandpassfilter zwischen 0,03 Hz und 200Hz. Marker Spule Positionen sind vor und nach Aufnahmen Kopfbewegung Maß erhalten. Die Daten werden abgelehnt, wenn Kopfbewegung ist größer als 5mm. MEG-System-Peripherie: Experimentelle Reize werden mit einem PC mit Presentation gesteuert ® (Neuropsychologische Systems, Albany, CA). Visuelle Eingänge werden durch einen Projektor, der außerhalb der MSR sitzt und auf die MSR-Bildschirm reflektiert geliefert. Auditive Reize werden von Etymotic Research Modell geliefert ER-30 Einsteckhörern mit Baby-Größe Schaumstoff Ohrmuscheln (Etymotic Research Inc., Elk Grove Village, IL) ausgestattet. Das Kind ist ständig von geschlossenen Kreislauf Kamera überwacht, und der Versuchsleiter kommuniziert mit dem Kind durch ein Mikrofon. 2.2 Daten Akquisition: Data Recording-Sessions beinhalten die folgenden Phasen: Stufe I: Vor dem Kind die Ankunft Es ist wichtig, auf allen Computern, Software und Geräte bereit, das Experiment, sobald das Kind kommt zu beginnen. Als allgemeine Empfehlung, sollten zwei erfahrene Forscher vorhanden sein, während das Kind und Eltern im Labor. Klare Kommunikation zwischen Wissenschaftlern, Eltern und Kind sind entscheidend für den Erfolg des Experiments. Stufe II: Nachdem das Kind kommt <ol><li> Einverständniserklärungen sind unterschrieben und die Experimentatoren überprüfen, ob die Eltern Fragen haben. </li><li> Der Versuchsleiter überprüft, ob das Kind merkt sich alle Schritte in der ersten Sitzung oder in den Broschüren eingeführt und wieder einführt alle, die nicht vergessen werden. Die Bedeutung des Einfrierens oder Minimierung Bewegung während der Digitalisierung und Datenerfassung wird betont. Dies lässt sich mit einer Marionette sein. </li><li> Dann prüft der Experimentator, wenn das Kind trägt keine eisenhaltigen Material (Kleidung mit Glitzer-Patches, Schmuck, Spielzeug Innentaschen vergessen, Haarnadeln, usw.). Wenn sie ein Kleidungsstück, das eisenhaltige Material enthält tragen, bieten wir ihnen mit MEG sichere Kleidung. Wenn die Eltern will das Kind während des Experiments zu begleiten, stellen wir sicher, dass sie auch entfernen, deren eisenhaltiges Material. </li></ol> Stufe III: Getting das Kind bereit, die Aufgabe in der MSR durchführen <ol><li> Der Versuchsleiter passt die Kappe, dass die 5-Marker Spulen hält. </li><li> Der Versuchsleiter digitalisiert die Lage der Marker Spulen und den Kopf des Kindes zu gestalten. Um den Kopf in einer festen Position zu halten, verwenden wir eine Halskrause, die mit drei Empfängern eingesetzt wurde. Es ist wichtig, die Idee der Minimierung Bewegung oder &quot;Einfrieren&quot; regelmäßig, um eine gute Kopfform erhalten zu verstärken. Das Kind kann mit einem Aufkleber für einen guten Job machen bei &quot;Einfrieren&quot; belohnt werden. </li><li> Das Kind wird gebeten, die MSR geben. Ohrhörer eingesteckt und das Kind ist in der MEG-Dewar Helm in Rückenlage positioniert. </li><li> Sobald das Kind im Liegen bequem mit dem Kopf in der MEG Helm, sind die Marker Spulen, um ihre Macht verbunden und die MSR Tür geschlossen ist. Ein Experimentator bleibt (und auch ein Elternteil, wenn gewünscht) in den Raum während der gesamten Sitzung. </li><li> Für Unterhaltung während des Setups und zwischen Datenerhebung blockiert, kann ein Film oder Cartoon auf die MSR Rückprojektion Leinwand projiziert werden. </li></ol> Stufe IV: Die Ausführung des Experiments <ol><li> Sobald die MSR Tür geschlossen ist, werden SQUIDs engagiert und Datenerfassung beginnt. </li><li> Als das Kind sieht einen Film, ein Koregistrierung Pre-Test wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass MEG-Signale können koregistrierten zu den digitalisierten Kopfform. Dieser Vortest besteht aus Anpassung der Position des Markers Spulen während der Digitalisierung mit der Position von der MEG-System gezeigt, erhalten. </li><li> Nachdem der erste Test zeigt, dass der Kopf des Kindes richtig im Helm positioniert, kann der Forscher Starten des Experiments: (a) der Film ist stumm; (b) der Forscher fragt das Kind, wenn sie bereit sind, &quot;das Spiel&quot; sind; (c) sobald das Spiel beginnt, der Experimentator stellt regelmäßig das Kind mit Feedback. Zum Beispiel kann ein Kind gebeten, sich auf eine Reihe von Sätzen zu hören, und auf ein Ziel Wort wie &quot;Käse&quot; zu wiederholen, sobald sie es hören. Diese Ziel-Worte sind in einer Teilmenge des Fangs tri embeddedlien, die Sonde Aufmerksamkeit weiterhin die Aufgabe, sind aber nicht in die endgültige Auswertung einbezogen. </li><li> Sobald die Aufgabe abgeschlossen ist, ist ein weiterer Marker Spule Messung durchgeführt, um die Kopfhaltung und Bewegung zu überwachen. </li><li> Sobald die SQUIDs gelöst sind, ist die MSR Tür öffnete sich und das Kind ist es, ein Spielzimmer, wo sie einen Preis für ihre gute Arbeit wählen können eingeladen. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Eine repräsentative Studie in unserem Labor verwendet dieses Protokoll, um die Entwicklung der Logik in der Kindersprache zu studieren. Sechsundzwanzig Kinder im Alter von 3-4 Jahren (mittleres Alter 4 Jahre und 5 Monate) nahmen an mindestens einer Übernahme Sitzung. Siebzehn dieser Kinder wieder für einen zweiten Test-Session und fünf kamen zum dritten Test-Session. Durchschnittliche Kopfbewegung war weniger als 3,7 mm (sd 3,1 mm), auch innerhalb der 5mm Schwelle. Movements größer als 5mm traten bei 4,5% der Sitzungen, mit einer Variation von 5,5 mm bis 15 mm (Mittelwert = 8,6 mm, sd = 2,5 mm). <img src="/files/ftp_upload/1693/1693fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die MSR-und MEG Helm haben mit Aufkleber und Stofftiere eingerichtet. <img src="/files/ftp_upload/1693/1693fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Vier Jahre altes Mädchen in Erwachsenen-Größe MEG (links). Beachten Sie die Polsterung an der Spitze ihres Kopfes, um Bewegung und der Abstand zwischen Kopf und Helm zu minimieren. Bild rechts zeigt dasselbe Mädchen in das Kind MEG.

<ol>
	<li>H&#228;m&#228;l&#228;inen, M., Hari, R., Ilmoniemi, R. J., Knuutila, J., Lounasmaa, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetoencephalography-+theory,+instrumentation,+and+applications+to+noninvasive+studies+of+the+working+human+brain.">Magnetoencephalography- theory, instrumentation, and applications to noninvasive studies of the working human brain.</a> Rev. Mod. Physics. 65 (2), 413-497 (1993).</li><li>Johnson, B. W., Crain, S., Thornton, R., Tesan, G., Reid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+brain+function+in+pre-school+children+using+a+custom+sized+whole-head+MEG+sensor+array.">Measurement of brain function in pre-school children using a custom sized whole-head MEG sensor array.</a> Clin. Neurophysiol. , (2009).</li><li>Kado, H., Higuchi, M., Shimogawara, M., Haruta, Y., Adachi, Y., Kawai, J., Ogata, H., Uehara, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetoencephalogram+system+developed+at+KIT.">Magnetoencephalogram system developed at KIT.</a> IEEE Trans. Appl. Supercond. 9, 4057-4062 (1999).</li><li>Uehara, G., Adachi, Y., Kawai, J., Shimogawara, M., Higuchi, M., Haruta, Y., Ogata, H., Kado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Channel+SQUID+Systems+for+Biomagnetic+Measurement.">Multi-Channel SQUID Systems for Biomagnetic Measurement.</a> IEICE Trans. Electr. E86-C, 43-54 (2003).</li></ol>

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Messungen der kognitiven Funktion des Gehirns bei gesunden und wachen 4 Jahre alten Kindern zu erleichtern. Wir verwenden einen benutzerdefinierten Formaten MEG-System entwickelt, um die Köpfe der Vorschul-Kinder im Alter fit. Mit diesem System eine kinderfreundliche Laborumgebung, und ein Protokoll angepasst, um die Fähigkeiten und Motivationen von Kindern, sind wir in der Lage, kognitive Funktion des Gehirns in einem Alter, für den gibt es derzeit nur sehr wenige Daten zu messen. Die KIT-Macquarie System ist das erste Ganzkörper-Kopf-System benutzerdefinierte Größe für den Einsatz mit bereits Kinder im Grundschulalter. Es gibt drei wesentliche Vorteile der maßgeschneiderten Helm Dewar für das Studium Kinder. Zunächst bringt der kleinere Radius des Sensors Konfiguration der SQUID-Sensoren in den Bereich der neuromagnetischen Signale von Kindern die Köpfe. Zweitens ermöglicht die kleineren Helm vollständige Einführung der Kopf eines Kindes in den Dewar. Vollständige Insertion ist in der Erwachsenenbildung Dewar Helme wegen der kleineren Krone Abstand bei Kindern Schulter (siehe Abb. 2). Verhindert. Diese beiden Faktoren sind grundlegend in der Aufnahme Hirnaktivität mittels MEG, weil neuromagnetischen Signale rasch dämpfen mit Abstand. Drittens schränkt die individuelle Kind Helm hilft bei der symmetrischen Positionierung des Kopfes und die Bewegungsfreiheit der Kopf des Kindes in den Dewar. Diese Funktionen deutlich erleichtern Setup, Positionierung und Messung von MEG-Signale von Kindern. Das Aufkommen von benutzerdefinierten Größe Kind MEG-System ist ein wichtiger Fortschritt für die kognitiven Neurowissenschaften. Alternative funktionelle bildgebende Verfahren, die Radiopharmaka oder starke Magnetfelder einzusetzen möglicherweise nicht geeignet für den routinemäßigen Einsatz mit kleinen Kindern. Da MEG ist eine völlig passive Messverfahren gibt es keine denkbare Risiko für die Entwicklung Gewebe. Es gibt derzeit nur sehr wenig MEG Daten von gesunden Vorschulkindern im Alter von Kindern, weil konventionelle Erwachsenen MEG-Systeme nicht gut geeignet, um mit Kindern eingesetzt. Child MEG-Systeme ermöglichen es uns, die Gehirnfunktion zu Studienbeginn im Alter, wo eine dramatische Gestaltung der Aktivität des Gehirns stattfindet, gibt neue Einblicke in normalen und pathologischen Entwicklung der kognitiven Funktion.

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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Whole head child MEG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kanazawa Institute of Technology (Kanazawa) and Yokogawa Electric Corporation (Tokyo)</td>
<td>Model PQ1064R-N2m</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetically shielded room</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fujihara Co. Ltd., (Tokyo)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitiser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polhemus (Colchester, VT)</td>
<td>Fastrack</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experimental control software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Neurobehavioral Systems (Albany, CA)</td>
<td>Presentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Earphones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Etymotic Research Inc. (Elk Grove Village, IL)</td>
<td>ER-30</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measurement of neuromagnetic brain function in pre-school children with custom sized meg

Magnetenzephalographie ist eine Technik, die Magnetfelder mit kortikale Aktivität [1] verbunden erkennt. Die elektrophysiologische Aktivität des Gehirns erzeugt elektrische Felder - das können Sie nur mit der Elektroenzephalographie (EEG) werden - und ihre gleichzeitige magnetische Felder - erkannt von MEG. MEG-Signale werden von spezialisierten Sensoren supraleitenden Quanten-Interferenz-Geräten (SQUIDs) bekannt erkannt. Supraleitende Sensoren benötigen mit flüssigem Helium-Kühlung bei -270 ° C. Sie befinden sich in einem vacumm isolierte Helm genannt Dewar, die mit Flüssigkeit gefüllt ist enthalten. SQUIDs sind in festen Positionen in den Helm Dewar in der Kühlmittel Helium gelegt, und ein Thema ist der Kopf im Helm Dewar für MEG-Messungen gelegt. Der Helm Dewar muss so bemessen sein, gegen Einschränkungen zu befriedigen. Klar, muss es groß genug, um die meisten oder alle die Köpfe in der Bevölkerung, die untersucht werden sollen fit. Allerdings muss der Helm auch klein genug, um die meisten der SQUID-Sensoren im Bereich der kleinen zerebralen Felder, die sie zu messen sind zu halten. Konventionelle ganzen Kopf MEG-Systeme wurden entwickelt, um mehr als 90% der erwachsenen Köpfen unterzubringen. Allerdings Erwachsenen-Systeme sind nicht gut für die Messung Gehirnfunktion in pre-school chidren deren Köpfe haben einen Radius mehrere cm kleiner als Erwachsene geeignet. Die KIT-Macquarie Hirnforschung Laboratory an der Macquarie University wird ein MEG-System benutzerdefinierte Größe, um die Köpfe der Kinder im Vorschulalter geeignet. Dieses Kind-System verfügt über 64 erster Ordnung axiale Gradiometer mit einem 50 mm Baseline [2] und befindet sich in einem magnetisch abgeschirmten Raum (MSR) zusammen mit einem herkömmlichen Erwachsenen-Größe MEG-System enthalten [3,4]. Es gibt drei wesentliche Vorteile der maßgeschneiderten Helm Dewar für das Studium Kinder. Zunächst bringt der kleinere Radius des Sensors Konfiguration der SQUID-Sensoren in den Bereich der neuromagnetischen Signale der Kinder-Köpfe. Zweitens ermöglicht die kleineren Helm vollständige Einführung der Kopf eines Kindes in den Dewar. Vollständige Insertion ist in der Erwachsenenbildung Dewar Helme wegen der kleineren Krone Abstand bei Kindern Schulter verhindert. Diese beiden Faktoren sind grundlegend in der Aufnahme Hirnaktivität mittels MEG, weil neuromagnetischen Signale rasch dämpfen mit Abstand. Drittens schränkt die individuelle Kind Helm hilft bei der symmetrischen Positionierung des Kopfes und die Bewegungsfreiheit der Kopf des Kindes in den Dewar. Wenn es mit einem Protokoll, das den Anforderungen der Datenerhebung deckt sich mit den motivationalen und Verhaltensstörungen Fähigkeiten von Kindern verwendet werden, diese Funktionen erheblich erleichtert Setup, Positionierung und Messung von MEG-Signalen.

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Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Das Aufkommen der MEG-Systeme Größe für Kleinkinder eröffnet wichtige neue Möglichkeiten für die Entwicklung des Gehirns zu studieren. Das neue System, zusammen mit einem Protokoll, das experimentelle Anforderungen deckt sich mit den Fähigkeiten von Kindern, lassen sich kognitive und sprachliche Prozesse bei gesunden, wachen Kindern im Alter von drei Minuten vor sechs studieren.

Measurement Of neuromagnetischen Hirnfunktionen Kinder im Vorschulalter mit benutzerdefinierten Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

measurement-neuromagnetic-brain-function-pre-school-children-with

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Aufrufe.  Macquarie University. Das Aufkommen der MEG-Systeme Größe für Kleinkinder eröffnet wichtige neue Möglichkeiten für die Entwicklung des Gehirns zu studieren. Das neue System, zusammen mit einem Protokoll, das experimentelle Anforderungen deckt sich mit den Fähigkeiten von Kindern, lassen sich kognitive und sprachliche Prozesse bei gesunden, wachen Kindern im Alter von drei Minuten vor sechs studieren.

Serie: Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Forschung

Biologie

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as language1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, memory11, and attention12 is underway worldwide involving adults, children and infants 3,4,13,14,15,16,17,18,19 with typical and atypical cognition20,21,22. The contemporary challenge of using fNIRS for cognitive neuroscience is to achieve systematic analyses of data such that they are universally interpretable23,24,25,26, and thus may advance important scientific questions about the functional organization and neural systems underlying human higher cognition.
Existing neuroimaging technologies have either less robust temporal or spatial resolution. Event Related Potentials and Magneto Encephalography (ERP and MEG) have excellent temporal resolution, whereas Positron Emission Tomography and functional Magnetic Resonance Imaging (PET and fMRI) have better spatial resolution. Using non-ionizing wavelengths of light in the near-infrared range (700-1000 nm), where oxy-hemoglobin is preferentially absorbed by 680 nm and deoxy-hemoglobin is preferentially absorbed by 830 nm (e.g., indeed, the very wavelengths hardwired into the fNIRS Hitachi ETG-400 system illustrated here), fNIRS is well suited for studies of higher cognition because it has both good temporal resolution (~5s) without the use of radiation and good spatial resolution (~4 cm depth), and does not require participants to be in an enclosed structure27,28. Participants cortical activity can be assessed while comfortably seated in an ordinary chair (adults, children) or even seated in mom s lap (infants). Notably, NIRS is uniquely portable (the size of a desktop computer), virtually silent, and can tolerate a participants subtle movement. This is particularly outstanding for the neural study of human language, which necessarily has as one of its key components the movement of the mouth in speech production or the hands in sign language. 
The way in which the hemodynamic response is localized is by an array of laser emitters and detectors. Emitters emit a known intensity of non-ionizing light while detectors detect the amount reflected back from the cortical surface. The closer together the optodes, the greater the spatial resolution, whereas the further apart the optodes, the greater depth of penetration. For the fNIRS Hitachi ETG-4000 system optimal penetration / resolution the optode array is set to 2cm. 
Our goal is to demonstrate our method of acquiring and analyzing fNIRS data to help standardize the field and enable different fNIRS labs worldwide to have a common background.

Here we describe a data collection and data analysis method for functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS), a novel non-invasive brain imaging system used in cognitive neuroscience, particularly in studying child brain development. This method provides a universal standard of data acquisition and analysis vital to data interpretation and scientific discovery.

Exploring Cognitive Functions in Babies, Kinder &amp; Erwachsene mit Nahinfrarot-Spektroskopie

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genome Editing mit CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Photodiodenbasierte optische Bildgebung zur Aufzeichnung der Netzwerkdynamik mit Einzelneuronauflösung bei nicht-transgenen Wirbellosen

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...