Wir sind dankbar, dass Matthew Robert Weatherhead für einen exzellenten technischen Service und John Ralph, University of Wisconsin für wertvolle Ratschläge, Diskussionen und die Pappel Probe. Diese Arbeit wurde von der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (Preis-Nr. DE-FG02-91ER20021) und durch das US Department of Energy (DOE) Great Lakes finanziert Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494).

1. Zellwand isoliert <ol><li> schleifen etwa 60-70mg von Luft-oder gefriergetrocknet Pflanzenmaterial mit 5,5 mm Edelstahl-Kugeln in einem 2ml Sarstedt Schraubverschluss Röhrchen mit einem retschmill (1 min, 25 Hz). Eine Alternative ist die Verwendung eines High-Throughput-Mahlen und Abfüllen Roboter bezeichnet iWall in Teil I 3 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die Stahlkugeln, bevor Sie mit der Zellwand isoliert Verfahren Das detaillierte Protokoll der Vorbereitung der Zellwand Material wird in Teil I 3 dargestellt. Der Vollständigkeit halber hier die schriftliche Schritte des Protokolls. </li><li> 1,5 ml 70% wässrigem Ethanol und gründlich vortexen </li><li> Zentrifuge bei 10.000 rpm für 10 min zur Pelletierung der Alkohol unlösliche Rückstand </li><li> Absaugen oder Dekantieren des Überstandes </li><li> 1,5 ml Chloroform / Methanol (1:1 v / v) Lösung des Rückstandes und schütteln Rohr gründlich, um das Pellet resuspendieren </li><li> Zentrifuge bei 10.000 rpm für 10 min und Verwerfen des Überstandes </li><li> Pellet in 500 ul Aceton </li><li> verdampft das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 ° C bis trocken Bei Bedarf getrockneten Proben können bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden. </li><li> Um die Entfernung von Stärke aus der Probe resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml einer 0,1 M Natriumacetat-Puffer pH 5,0 zu initiieren. </li><li> Kappe der Sarstedtröhrchen und Wärme für 20 min. bei 80 ° C in einem Heizblock. </li><li> Kühlen der Suspension auf Eis </li><li> fügen Sie die folgenden Substanzen, um das Pellet: 35 ul von 0,01% Natriumazid (NaN 3), 35 ul Amylase (50 μg/1mL H 2 O, von Bacillus-Arten, SIGMA), 17 ul Pullulanase (18,7 Einheiten aus Bacillus acidopullulyticus; SIGMA) . Cap der Röhre und gründlich vortexen. </li><li> Die Suspension wird über Nacht bei 37 ° C in den Shaker. Die Ausrichtung der Rohre horizontal Helfer eine bessere Durchmischung. </li><li> Wärme Suspension bei 100 ° C für 10 min in einem Heizblock, um die Verdauung zu kündigen. </li><li> Zentrifuge (10.000 rpm, 10 min) und Überstand verwerfen, die solubilisierten Stärke </li><li> Waschen Sie die verbleibende Pellet dreimal durch Zugabe von 1,5 ml Wasser, Vortex, centriguation und Dekantieren des Waschwassers. </li><li> Pellet in 500 ul Aceton </li><li> verdampft das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 ° C, bis es trocken. Es kann notwendig sein auch zu brechen das Material in der Röhre mit einem Spatel für eine bessere Trocknung. Das getrocknete Material präsentiert isoliert Zellwand (Lignocellulose). Bei Bedarf getrockneten Proben können bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden. </li></ol> 2. Matrix Polysaccharidzusammensetzung Diese Methode ist im wesentlichen eine Modifikation des Verfahrens von Albersheim 1 veröffentlicht. <ol><li> Zur Bestimmung der Monosaccharid-Zusammensetzung des Wandmaterials wiegen 2 mg Zellwand Material in 2ml starstedt Rohre entweder von Hand oder in einem hohem Durchsatz Weise mit dem iWall, ein Roboter-Schleif-und einem Gewicht von Roboter. </li><li> Fügen Sie 20 uL einer Inositol-Lösung (5mg/ml) als interner Standard. Für eine 2 mg Zellwand Probe empfehlen wir 100 ug hinzuzufügen. </li><li> Spülen Rohrwandungen mit 250 ul Aceton an die Zellwand Material auf den Boden des Röhrchens zu sammeln und verdampft das Aceton sehr sanft unter Luftstrom. </li><li> Für die Schwachen saure Hydrolyse add 250 ul 2M Trifluoressigsäure (TFA) zu jeder Probe. Add TFA sorgfältig, um sicherzustellen, kein Material bis auf das Rohr Wände spritzte. </li><li> Kappe dicht und Inkubation für 90 min bei 121 ° C in einem Heizblock. </li><li> kühlen die Heizblöcke und Proben auf Eis. </li><li> zentrifugieren bei 10.000 rpm für 10 min. </li><li> Transfer 100 ul der sauren Überstand, der die Matrix Polysaccharid abgeleitet Monosaccharid, ein Glas Schraubverschluss Fläschchen macht sicher nicht für die Pellet-Material zu stören. Das Pellet kann für die kristalline Cellulose-Assay unter verwendet werden (siehe 3). </li><li> verdampft das TFA in das Glasrohr unter einem leichten Luftstrom in eine Verdampfungseinrichtung. </li><li> add 300 pl 2-Propanol, Wirbel und verdampfen bei 25 ° C (Wiederholung für insgesamt dreimal) </li><li> Der erste Schritt der Alditolacetat Derivatisierung Verfahrens ist es, eine Reduktion der Monosaccharide in ihre entsprechenden Alditolen durchzuführen. Zu diesem Zweck fügen Sie 200 ul einer Natriumborhydrid-Lösung in jede getrocknete Probe. Bereiten Sie eine neue Lösung jedes Mal mit 10 mg Natriumborhydrid pro 1 ml 1M Ammoniumhydroxid. </li><li> verlassen Glasflasche bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden </li><li> neutralisieren die Lösung durch Zugabe von 150 ul Eisessig </li><li> Wirbel und bei 25 ° C verdampft. </li><li> add 250 ul Essigsäure / Methanol (1:9, v / v), Vortex-und verdampfen bei 25 ˚ C </li><li> add 250 ul Methanol und dampft unter Luftstrom (Wiederholung für insgesamt drei mal) </li><li> Für die Acetylierung der Alditole add 50 ul Essigsäureanhydrid und 50 ul Pyridine, Wirbel und Inkubation für 20 min bei 121 ° C in einem Heizblock. </li><li> kühlen Proben in den Block mit Eis, während für Temp. Rückgang warten, bis etwa Raumtemperatur. </li><li> verdunsten die Reagenzien unter einem leichten Luftstrom bei Raumtemperatur. Seien Sie vorsichtig: Alditolacetaten sehr volatil sind. </li><li> mit 200 ul Toluol und an der Luft verdampfen (x3) </li><li> In den letzten Schritten der Alditolacetaten extrahiert werden. Fügen Sie zuerst 500 ul Ethylacetat und Drall leicht. </li><li> 2 ml Wasser, cap Rohre und Wirbel. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 2.000 RPM für 5 min zu klar getrennten Schichten (Ethylacetat auf, Wasser auf der Unterseite) zu erhalten </li><li> Je 50 ul der Ethylacetatschicht in GC / MS Fläschchen mit Einsätzen. </li><li> verdünnt durch Zugabe von 100 ul Aceton auf die GC-Fläschchen und Mütze. Das Probenvolumen und Verdünnungsmengen können angepasst werden, um eine Überlastung der GC / MS, wenn die Konzentration der Probe ist zu hoch. Die GC-Fläschchen können bei 4 ° C, wenn der GC / MS-Analyse nicht sofort gehen gelagert werden </li><li> Die Proben werden in ein GC, der mit einem Quadrupol-MS ausgestattet injiziert wird, sondern ein Flammenionisationsdetektor ist ebenfalls geeignet. Ein Supelco SP-2380 (30mm x 0,25 x 0,25 um Filmdicke)-Spalte mit einer 4min Lösungsmittel Verzögerung und einer Durchflussrate von 1.5ml/min verwendet wird. Injected Proben werden auf die folgenden Temperaturprogramm unterworfen: Initial halten bei 160 ° C für 2 min; 20 ° C / min Rampe bis 200 ° C und für 5 min halten, ein 20 ° C / min Rampe bis 245 ° C und halten 12 min; spike bis 270 ° C und für 5 min halten vor dem Abkühlen auf die anfängliche Temperatur von 160 ° C 2,26) Peaks Masse Profile und / oder Retentionszeiten von Standards identifiziert werden.. Monosaccharide basieren auf Standard-Kurven quantifiziert. </li></ol> 3. Kristalliner Cellulose Inhalt Diese Methode wird im Wesentlichen durch Updegraf 8 beschrieben. Es gibt eine Reihe von Ausgangsmaterialien für dieses Verfahren: Isolierte Zellwandmaterial (siehe 1) oder an der Wand Material, das bereits mit 2M TFA (siehe 2.8) entweder die verbleibende Pellet sofort nach der Säurebehandlung (siehe 2.8) oder eine TFA behandelt worden Pellet, das mit 2-Propanol und getrocknet worden ist, gewaschen. <ol><li> Hinzufügen, um die TFA Pellet in die Schraube verschlossen Glasrohr 1 ml Updegraff Reagenz (Essigsäure: Salpetersäure: Wasser, 8.01.02 v / v). </li><li> Cap Röhrchen fest, Wirbel, und Wärme in einem Heizblock bei 100 ° C für 30 min. Als Ergebnis dieser Behandlung nur kristalline Cellulose bleibt unlöslich im Pellet. </li><li> Coole Proben in den Block auf dem Eis zu Raumtemperatur oder kälter </li><li> Zentrifuge Proben bei 10.000 rpm für 15 min </li><li> Überstand sicherzustellen, dass die Pellets nicht gestört wird und kein Material aus dem Pellet entfernt wird. Zu diesem Zweck verlassen ca.. 150 ul des Überstandes in die Röhre. </li><li> 1,5 ml Wasser, schütteln, zentrifugieren und Überstand verwerfen wie oben beschrieben einstellen </li><li> wiederholen Waschvorgang 3 weitere Male mit 1,5 ml Aceton </li><li> Der Luft trocknen lassen Pellet sehr vorsichtig mit Luft, oder lassen Sie auf der Bank über Nacht trocknen </li><li> das Pellet (kristalline Cellulose) ist nun vollständig hydrolysiert in Glukose durch eine sogenannte Saeman Hydrolyse. Zu diesem Zweck fügen Sie 175 ul 72% Schwefelsäure zu der Sarstedt Röhre </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min, Wirbel und Inkubation für weitere 15 min </li><li> add 825 ul Wasser und Wirbel </li><li> Zentrifuge Proben bei 10.000 rpm für 5 min. Es mag einige braune unlösliche Material, Lignin, noch in der Röhre. </li><li> Die Glucose-Gehalt des Überstandes wird unter Verwendung der kolorimetrischen Anthron-Test. Dieser Test wird in einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatte durchgeführt. </li><li> Für die Standardkurve verwenden 1mg/ml Glukose Lager (gelagert bei 0 ° C) und erstellen Sie doppelte 0, 2, 4, 6, 8 und 10 ug Standards durch Pipettieren 0, 2, 4, 6, 8 und 10 ul in getrennte geeignete gut. Füllen Sie jede Vertiefung bis zu 100 ul mit Wasser. </li><li> add 10 ul jeder Probe Überstand und 90 ml Wasser in separate Zellen, sondern auf der gleichen Mikrotiterplatte als Standard. </li><li> mit 200 ul frisch zubereitet Anthron-Reagenz (Anthron in konzentrierter Schwefelsäure, 2 mg Anthron / ml Schwefelsäure gelöst) </li><li> Heizplatte für 30 min bei 80 ° C in einem Ofen (Aluminium Heatspreader). Glucose Proben wiederum von Gelb in Blau-Grün. </li><li> lassen Sie den Teller abkühlen lassen, um bei Raumtemperatur und schütteln. </li><li> Lesen Absorption der Platte bei 625 mm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät. </li><li> Glucose (und damit kristalline Cellulose-Gehalt) wird basierend auf der Absorption im Vergleich zu den Standard-Kurve auf der gleichen Platte etabliert berechnet. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine Wand-Analyse ist in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Fall Pappel Stamm (Holz) wurde durch die verschiedenen Verfahren in das Protokoll Abschnitt beschrieben analysiert. Die Matrix polysaccharide Zusammensetzung wird durch ein Beispiel Chromatogramm Identifizierung der typischen Zucker in pflanzlichen Zellwänden hervorgehoben, Fucose, Rhamnose, Xylose, Arabinose, Galaktose, Mannose und Glucose (und der interne Standard Inosit). Die wichtigsten Hemicellulose Bestandteil der Pappel ist Xylan als durch die hohe Xylosegehalt demonstriert. Allerdings wird die Fülle dieser Zucker je nach Ausgangsmaterial Gebraucht4. Die Glukose in dieser Analyse ist aus der Hemizellulose Xyloglucan und amorpher Cellulose abgeleitet. Aufgrund der Analyse der Daten kann als mol% oder ug / mg Wandmaterial (oder Trockengewicht) vorgestellt werden. Für den Inhalt der kristalliner Cellulose ist selbsterklärend, kann man Werte zwischen 20-50% der Wand Trockengewicht erwarten. Basierend auf den hier vorgestellten Ergebnisse und in Teil I3 des lignocellulosischen Zusammensetzung aus Pappelholz ist 21% Lignin, 30% Hemicellulosen und 41% kristalline Cellulose. Der Rest würde Asche. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1:. Übersicht von Lignocellulose-Analyse Zellwände (Lignocellulose) werden aus Rohöl getrocknetes Pflanzenmaterial isoliert. Die Wand wird anschließend in Aliquots gewichtet und unterteilt für die verschiedenen Tests. Matrix Polysaccharidzusammensetzung ist nach der Behandlung das Wandmaterial mit einer schwachen Säure (2M TFA), Derivatisierung der daraus resultierenden solubilisierten Monosaccharide, ihre Alditolacetaten und Analyse mittels GC-MS etabliert. Der Rückstand der schwachen Säure-Behandlung wird mit der sogenannten Updegraff Reagenz bleibt nur unlösliche Cellulose crystlline hinter gewaschen. Die Cellulose wird durch Schwefelsäure gelöst und quantifiziert durch einen kolorimetrischen Test Bestimmung der Glucose-Gehalt. Parallel dazu kann der Inhalt und die Zusammensetzung von Lignin bestimmt, wie in Teil I 3 beschrieben werden. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2:. Umfassende lignocellulosischen Analyse von Pappelholz Hackschnitzel aus Pappel (Populus tremoloides) wurden zu den beschriebenen Protokoll unterzogen. Oben links: Matrix Polysaccharidzusammensetzung; Fuc Fucose; Rha Rhamnose; Ara Arabinose; Xyl Xylose; Man Mannose, Galaktose Gal; Glc Glucose; Inositol interner Standard.

<ol>
	<li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography.">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+I:+Lignin.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases.">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li><li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS.">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li></ol>

Die beschriebenen Methoden ermöglichen eine schnelle quantitative Abschätzung der Zusammensetzung von Lignocellulose-Biomasse-Anlage. Die Methode ermöglicht die Bestimmung der Zusammensetzung von solchen Materialien einschließlich der Zucker Zusammensetzung der Matrix Polysaccharide nämlich die Hemicellulosen, die kristalline Cellulose-Gehalt. Der Durchsatz der verschiedenen analytischen Methoden pro Person variiert. Mit der beschriebenen Protokolle hier aus können 20 Proben für die Matrix-Polysaccharid-Kompositionen und 30 für kristalline Cellulose-Gehalt verarbeitet werden. Durch die quantitative Natur der Daten optimal Rohstoff Getreide können Sorte oder Genotypen in Bezug auf ihre Eignung für die Produktion von Biokraftstoffen bewertet werden.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myo-Inositol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Borohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>213462</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>3348-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetic Anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>320102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectromax Plus 384</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Plus384</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>7890A GC/5975C MSD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5.5mm Stainless Steel Balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salem Ball Company</td>
<td>(N/A)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate heat spreader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocision</td>
<td>Coolsink 96F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>TissueLyser II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>Dri-block DB-3D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sample concentrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>FSC400D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part ii: carbohydrates

Der Bedarf an erneuerbaren, klimaneutralen und nachwachsenden Rohstoffen für die Industrie und die Gesellschaft hat sich zu einem der drängendsten Probleme des 21. Jahrhunderts. Dies hat das Interesse an der Verwendung von pflanzlichen Erzeugnissen als industrielle Rohstoffe für die Produktion von flüssigen Kraftstoffen für den Transport neu entfacht<sup&gt; 2</sup&gt; Und andere Produkte wie Biokomposit Materialien<sup&gt; 6</sup&gt;. Pflanzlicher Biomasse bleibt eines der größten unerschlossenen Reserven auf dem Planeten<sup&gt; 4</sup&gt;. Es ist vor allem der Zellwände, die von energiereichen Polymeren, einschließlich Cellulose, Hemicellulosen verschiedene, und das Polyphenol Lignin sind zusammen<sup&gt; 5</sup&gt; Und damit manchmal Lignocellulose bezeichnet. Allerdings haben pflanzlichen Zellwände entwickelt, um widerspenstig, um den Abbau als Wände weitgehend dazu beitragen, die Stärke und die strukturelle Integrität der gesamten Anlage. Trotz seiner notwendige Steifigkeit, ist die Zellwand ein sehr dynamisches Unternehmen, das metabolisch aktiv ist und spielt eine entscheidende Rolle in zahlreichen Zell-Aktivitäten wie das Pflanzenwachstum und die Differenzierung<sup&gt; 5</sup&gt;. Aufgrund der vielfältigen Funktionen von Wänden, gibt es eine immense strukturelle Vielfalt innerhalb der Mauern der verschiedenen Pflanzenarten und Zelltypen innerhalb einer einzigen Anlage<sup&gt; 4</sup&gt;. Daher, je von dem, was Pflanzenarten und Abwechslung, oder Pflanzengewebe ist für eine Bioraffinerie verwendet wird, müssen die Verarbeitungsschritte für Depolymerisation durch chemische / enzymatische Prozesse und die anschließende Vergärung der verschiedenen Zuckerarten auf flüssige Biokraftstoffe angepasst und optimiert werden. Diese Tatsache unterstreicht die Notwendigkeit, für eine gründliche Charakterisierung pflanzlicher Biomassen. Hier beschreiben wir eine umfassende analytische Methode, die Bestimmung der Zusammensetzung von Lignocellulose ermöglicht und ist offen für eine mittel-bis High-Throughput-Analyse (Abbildung 1). Das Verfahren beginnt mit der Vorbereitung der Stärke befreite Zellwandmaterial. Die daraus resultierende Lignocellulose werden dann bis zu seinem Monosaccharidzusammensetzung der Hemicellulosen und anderen Matrix polysaccharides1, und sein Gehalt an kristalliner Cellulose bestimmen split<sup&gt; 7</sup&gt;. Das Protokoll für die Analyse der Lignin-Komponenten in Lignozellulose wird in Teil I<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Wand abgeleitet Kohlenhydrate.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

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29.9K Aufrufe.  Michigan State University (MSU). Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Wand abgeleitet Kohlenhydrate.

Serie: Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Forschung

Biologie

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Label-freie In situ Imaging der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...