Verwenden Sie für die Isolierung der murinen Dünndarmkrypta ordnungsgemäß gewaschene fünf Millimeter mal fünf Millimeter große Fragmente des isolierten murinen Dünndarms. Inkubieren Sie die Stücke in PBS-Antibiotika, die zwei millimolare EDTA enthalten, 30 Minuten lang auf Eis, ohne zu schütteln. Um die Verfestigung der extrazellulären Matrix (EZM) zu erleichtern, inkubieren Sie vorher eine 24-Well-Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Nachdem Sie die EDTA-Lösung aus den Gewebefragmenten abgesaugt haben, fügen Sie 25 Milliliter frische, kalte PBS-Antibiotika hinzu. Schütteln Sie den Behälter dann 30 bis 40 Mal kräftig von Hand. Filtern Sie die Suspension einmal durch ein 70-Mikron-Sieb.
Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, bestätigen Sie das Vorhandensein der Krypten unter dem Mikroskop. Anschließend zentrifugieren Sie die Suspension drei Minuten lang bei 390 G und vier Grad Celsius. Anschließend wird das Kryptenpellet in 20 Millilitern DMEM, das 2 % Sorbit enthält, erneut suspendiert, im Folgenden als Sorbitol-DMEM bezeichnet.
Füllen Sie je 10 Milliliter der Kryptensuspension in zwei neue 15-Milliliter-Röhrchen um. Diesmal zentrifugieren Sie die beiden Röhrchen mit einer niedrigeren Geschwindigkeit von 80 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius, um die großen Zellmassen von den Zellen oder Trümmern zu trennen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und lassen Sie etwa zwei Milliliter Überstand in jedem Röhrchen.
Geben Sie dann 10 Milliliter Sorbit DMEM in jedes Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension erneut bei 80 G und vier Grad Celsius für drei Minuten. Saugen Sie den Überstand wie zuvor gezeigt ab und fügen Sie 10 Milliliter Sorbit DMEM zur Resuspension hinzu.
Fügen Sie nach dem Ansaugen des Überstands 10 Milliliter vollständiges DMEM hinzu und suspendieren Sie das Pellet durch Auf- und Abpipettieren erneut. Lassen Sie die Aufhängung eine Minute ruhen, um die schwebenden Krypten effizient zu erhalten. Filtern Sie die Suspension nach einer Minute aus beiden Röhrchen durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein frisches Röhrchen, um die Krypten zu reinigen.
Um die reinen Krypten vor der Aussaat zu zählen, träufeln Sie 25 Mikroliter Tröpfchen an drei Stellen in eine sechs Zentimeter große Schale. Zählen Sie die Anzahl der Krypten unter dem Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung und berechnen Sie die Konzentration der Krypten pro 25 Mikroliter. Anschließend wird das gesamte Filtrat bei 290 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Für die Aussaat werden die Krypten in ECM in einer Konzentration von 100 Krypten pro 40 Mikroliter ECM suspendiert. Pipettieren Sie es fünf- bis 10-mal vorsichtig auf und ab und vermeiden Sie dabei vorsichtig Luftblasen, um eine homogene Suspension zu erhalten. Dann 40 Mikroliter der Kryptensuspension pro Well in die vorgewärmte 24-Well-Platte geben.
Inkubieren Sie die 24-Well-Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für die Polymerisation des ECM. Decken Sie die EZM pro Well mit 500 Mikrolitern Nährmedium ab, das den epidermalen Wachstumsfaktor der Maus, das rekombinante R-Spondin 1 der Maus und das rekombinante Mausnoggin enthält. Die endgültige Konzentration der Materialien pro Bohrung ist hier dargestellt.
Kultivieren Sie die Krypten, indem Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Führen Sie bis zu sieben Tage lang alle drei Stunden Live-Bildgebung durch, um die Morphogenese von Organoiden mit einem Zeitraffer-Bildmikroskop aufzuzeichnen, und erhalten Sie serielle Z-gestapelte Bilder. Fast alle isolierten Krypten wurden sofort versiegelt und erschienen kegelförmig, sobald sie aus den Epithelnischen gepresst wurden.
Des Weiteren wurden die Krypten in der Endfraktion integriert und kulturfähig gemacht. Zeitrafferaufnahmen des Organoidwachstums zeigten, dass eine aktive Proliferation und Differenzierung von intestinalen Stammzellen in der Kryptenregion mit Knospung stattfand. Die Knospung war mit Zellmigration, Proliferation und Paneth-Zelldifferenzierung gekoppelt.
