Säen Sie zunächst die 143B humanen Osteosarkomzellen in einer Sechs-Well-Platte. Sobald die Zellen zu 75 % zusammenfließen, wird das Medium in jeder Vertiefung durch das Medium ersetzt, das 10 millimolare 13C4-Aspartat enthält, und acht Stunden lang inkubiert, um einen stabilen Zustand für die Markierung der Zellen zu erreichen. Um Metaboliten zu isolieren, kühlen Sie den vorbereiteten Puffer über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ab oder legen Sie ihn auf Trockeneis.
Nehmen Sie in der Zwischenzeit eine Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium mit einer Pipette aus jeder Vertiefung ab. Waschen Sie es zweimal mit PBS und entfernen Sie dann das restliche PBS, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie nun die Platte auf Trockeneis und geben Sie 800 Mikroliter vorbereiteten Puffer in jede Vertiefung.
Um die Zelllyse zu erleichtern, inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird jede Vertiefung mit einem Zellheber auf Trockeneis abgekratzt und das Lysat in ein 15-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis überführt. Das Lysat 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius vortexen und 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 17.000 g zentrifugieren.
Anschließend wird der Überstand in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und in einem vier Grad Celsius heißen Vakuumkonzentrator mit Kühlfalle unter Hochvakuum für etwa sechs Stunden getrocknet. Lagern Sie das getrocknete Metaboliten-Pellet bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Für die Analyse der Probe mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie oder LCMS werden dem getrockneten Pellet und dem Wirbel wie gezeigt 100 Mikroliter Wasser in HPLC-Qualität zugegeben.
Zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit. Übertragen Sie dann 25 Mikroliter Überstand in die LCMS-Durchstechflasche und injizieren Sie zwei Mikroliter in das LCMS-System. Um die Flüssigkeitschromatographie durchzuführen, verwenden Sie eine konstante Flussrate von 0,15 Milliliter pro Minute im Gradientenmodus einer mobilen Phase B von 80 bis 20 % für 20 Minuten, 20 bis 80 % für 0,5 Minuten und halten Sie bei 80 % für 7,5 Minuten gegen die mobile Phase A. Führen Sie als Nächstes eine Massenspektroskopie durch, indem Sie einen vollständigen Scan zwischen mz 70 und 1 auswählen. 000 Dalton.
Und Auflösung bei 70.000. Legen Sie das AGC-Ziel von eins mal 10 auf die sechste und eine maximale Injektionszeit von 20 Millisekunden fest. Stellen Sie als Nächstes die Laufzeit auf 16,5 Minuten ein.
Polarität auf positiv eingestellt. Das AGC-Ziel wurde auf eins hoch fünf gesetzt. Die maximale IT-Auslastung ist auf 20 Millisekunden festgelegt.
Und der Scanbereich ist auf ein Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 70 zu 1.000 eingestellt. Stellen Sie dann die Sprühspannung auf 3,0 Kilovolt ein. Und die bei 275 Grad Celsius erhitzte Kapillare.
Wählen Sie den Mantelgasstrom bei 40 Einheiten, den Hilfsgasstrom bei 15 Einheiten und den Sweep-Gasstrom bei einer Einheit. Für die Verfolgung von 13C5-Glutamin-Isotopen wird das Medium nach Erreichen einer Konfluenz von 75 % auf zwei millimolare 13C5-glutaminhaltige Medien umgestellt und inkubiert, um einen stabilen Zustand der Markierung der interessierenden Zellen zu erreichen. Isolieren und analysieren Sie die Metaboliten wie zuvor gezeigt.
Nachdem Sie die Metaboliten isoliert und analysiert haben, analysieren Sie die Succinat-Dehydrogenase- oder SDH-Aktivität, indem Sie die prozentuale Markierung von 13C3-Fumarat, 13C4-Fumarat, 13C3-Succinat und 13C4-Succinat berechnen. Bewerten Sie dann die Oxidation von Succinat und die Fumaratreduktion mit der Formel. Unter fahrzeugbehandelten Bedingungen begünstigte der SDH-Komplex die Vorwärtsaktivität, und der Einbau von 13C4-Succinat in 13C4-Fumarat war höher als der von 13C3-Fumarat in 13C3-Succinat.
In Antimycin-behandelten Osteosarkomzellen begünstigte der SDH-Komplex die umgekehrte Aktivität, und der Einbau von 13C3-Fumarat in 13C3-Succinat war signifikanter als der Einbau von 13C4-Succinat in 13C4-Fumarat.
