Beginnen Sie mit der Herstellung einer ausreichenden Menge Elektroporationsmischung für die Kontrolle und das Gen von Interesse. Verbinden Sie die Elektrodenkammer der Petrischale mit dem Elektroporator. Füllen Sie dann mit Microloader-Spitzen die Mikroinjektionsnadeln mit 8 Mikrolitern jeder Elektroporationsmischung.
Schneiden Sie die Nadelspitzen vor Gebrauch mit einer feinen Schere ab, um einen stabilen Fluss zu erreichen. Achten Sie darauf, nur einen kleinen Teil der Spitze zu entfernen, da eine stumpfe und breite Spitze die Organoide stark beschädigen kann. Wählen Sie unter dem Mikroskop fünf Hirnorganoide mit glatten Rändern und sichtbaren ventrikelartigen Strukturen aus.
Dann werden sie mit einer abgeschnittenen 1000-Mikroliter-Pipettenspitze in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale mit vorgewärmtem DMEM/F-12 gegeben. Führen Sie nun die Nadel vorsichtig durch die Wand einer ventrikelartigen Struktur ein und infundieren Sie sie mit der Elektroporationsmischung, bis sie sichtbar gefüllt ist. Üben Sie keinen übermäßigen Druck auf ventrikelartige Strukturen aus, um ein Platzen zu vermeiden.
Übertragen Sie ein mikroinjiziertes Hirnorganoid mit einer kleinen Menge DMEM/F-12 in die Elektrodenkammer der Petrischale. Ordnen Sie das Organoid so an, dass die Oberflächen der mikroinjizierten ventrikelartigen Strukturen zur Elektrode zeigen, die mit dem Pluspol des Elektroporators verbunden ist. Elektroporieren Sie nun die zerebralen Organoide nacheinander mit fünf Impulsen von 80 Volt für jeweils 50 Millisekunden im Abstand von einer Sekunde.
Wenn die Mikroinjektion und die Elektroporation unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wurden, werden die elektroporierten Organoide unter einer Laminar-Flow-Haube in eine neue 35-Millimeter-Zellkulturschale gebracht, die mit vorgewärmtem DMEM/F-12 gefüllt ist. Dann kultivieren Sie die elektroporierten Organoide in DM mit Vitamin A auf einem Orbitalschüttler bei 55 U/min in einer gedemütigten Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag, nach der Elektroporation, überprüfen Sie die zerebralen Organoide unter einem herkömmlichen inversen Fluoreszenzmikroskop auf erfolgreiche Elektroporation.
Die elektroporierten Organoide werden mit einer abgeschnittenen 1000-Mikroliter-Pipettenspitze in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und überschüssiges Medium entfernt. Fügen Sie eine ausreichende Menge 4%Paraformaldehyd in DPBS hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation wird das Paraformaldehyd abgesaugt.
Fügen Sie dann 5 Milliliter DPBS hinzu, schütteln Sie es leicht und saugen Sie das DPBS ab. Lagern Sie die Organoide bis zur weiteren Verwendung in DPBS bei 4 Grad Celsius. Zwei Tage nach der Elektroporation sind GFP-positive Zellen fast ausschließlich in der ventrikulären Zone lokalisiert und positiv für Pax6, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Zellen um apikale Vorläuferzellen oder neugeborene basale Vorläuferzellen handelt.
Nach 10 Tagen sind die GFP-positiven Zellen in den Basalregionen lokalisiert. Diese Zellen sind auch positiv für Pax6 oder NeuN, was auf basale Vorläuferzellen bzw. Neuronen hinweist. Es wird eine 3-D-Rekonstruktion der elektroporierten zerebralen Organoide gezeigt, um einen Eindruck von der 3-D-Verteilung der GFP-positiven Zellen zu erhalten.
