Um mit der Bildgebung transfizierter HeLa-Zellen zu beginnen, wählen Sie eine ausreichend lange Belichtungszeit für die einzelnen Fluoreszenzkanäle im Live-View-Modus basierend auf den von der Bildgebungssoftware erzeugten Intensitätshistogrammen. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Ebenen für die Bildgebung auf der Z-Achse fest. Wählen Sie die entsprechende Anzahl von Sichtfeldern aus, die pro Vertiefung angezeigt werden sollen.
Um mit der quantitativen Analyse der aufgenommenen Bilder zu beginnen, führen Sie eine Hintergrundkorrektur für alle Bilder aus allen Fluoreszenzkanälen durch. Wählen Sie je nach Größe der analysierten Objekte die entsprechende Filtergröße aus. Beginnen Sie als Nächstes mit der Bildsegmentierung, indem Sie eine Maske des Hauptobjekts erstellen, die auf dem Verhältnis der Intensität des Fluoreszenzsignals zum Hintergrund für den Kanal basiert, der den Zellkernen entspricht.
Erstellen Sie Masken für die Unterobjekte, die BrdU und mitochondriale DNA-Spots darstellen, indem Sie die Fluoreszenzkanäle verwenden, die für die gegebenen Strukturen geeignet sind. Stellen Sie die Parameter ein und messen Sie die Intensität der einzelnen Pixel innerhalb jeder Maske für alle Fluoreszenzkanäle. Um die Gesamtfluoreszenzintensitäten für den BrdU oder den mitochondrialen DNA-Kanal zu erhalten, summieren Sie die Intensitäten aller Unterobjekte, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind.
Um die mittlere Fluoreszenzintensität zu erhalten, dividieren Sie die gesamte Fluoreszenzintensität durch die Summe der Fläche der Unterobjekte, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind. Die Bildgebungsergebnisse wurden durch die Messung der mitochondrialen DNA und der Genexpression mittels quantitativer real-time PCR verifiziert. Die Behandlung mit Didesoxycytidin oder DDC führte zu einer sehr starken Abnahme der mitochondrialen DNA-Spiegel.
Ein schwächerer Effekt wurde beim Stummschalten von TFAM- und TWINKLE-Helikasen beobachtet, während die Transfektion von Zellen mit mitochondrialer DNA-Polymerase gamma oder POLG-siRNA einen bescheidenen Effekt auf die mitochondriale DNA-Kopienzahl hatte. Die Quantifizierung der Helikase-Expression von TFAM und TWINKLE bestätigte eine effiziente Reduktion der mRNA-Expression auf etwa 15 bis 20 % der Kontrollwerte. In POLG war die mRNA-Expression nur auf 30% reduziert, was den unerwartet bescheidenen Effekt auf die mitochondriale DNA-Kopienzahl erklärt.
