Nehmen Sie eine vorbereitete HPF- und FSF-behandelte Saphirscheibe, die stabile HeLa-Zellen enthält, waschen Sie sie fünf Minuten lang mit PBS-A-Puffer und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Die Saphirscheiben werden in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit einem Milliliter PBS-A-Puffer bei Raumtemperatur überführt. Ersetzen Sie den PBS-A-Puffer in der Kulturschale durch einen Milliliter Reduktionslösung und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
Bereiten Sie die Goldvorstufe in einem Milliliter Reduktionslösung vor und mischen Sie sie sofort durch Vortexen. 80 Mikroliter 500-Millimolar-D-Penicillamin in doppelt destilliertem Wasser in die Goldvorläuferlösung geben. Und sofort wirbeln.
Ersetzen Sie die Lösung in der kultivierten Schale durch einen Milliliter Goldvorläuferlösung und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Geben Sie 20 bis 100 Mikroliter der frisch zubereiteten Natriumborhydridlösung in die Goldvorläuferlösung, schütteln Sie sie sofort, um sie gut zu vermischen, und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie die Lösung durch zwei Milliliter PBS-A-Puffer, um die Reaktion zu stoppen.
Bereiten Sie dann die Epoxidharzmischung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, übertragen Sie die Saphirscheiben in Einbettkapseln mit flachem Boden und infiltrieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Harz. Polymerisieren Sie die Probe bei 60 Grad Celsius in einem Ofen für mindestens 18 Stunden. Bereiten Sie ultradünne Schnitte der polymerisierten Probe vor, indem Sie die Probenblöcke vorsichtig mit einem Rasiermesser abschneiden, um die Saphirscheiben freizulegen.
Tauchen Sie die Blockspitzen mit Saphirscheiben einige Sekunden lang in flüssigen Stickstoff und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Wiederholen Sie den Gefrier-Tau-Vorgang mehrmals, um die Discs von den Blöcken zu lösen. Das EGFP-MTn-KDEL-Protein erschien als zwei bis fünf Nanometer große Goldnanopartikel, die ausschließlich im peripheren ER-Lumen und im perinukleären Raum der Kernhülle verteilt sind.
Die gut erhaltene Ultrastruktur ermöglichte die Identifizierung von markierten Proteinen durch einzelne Moleküle und erleichterte die Analyse von Organelleninteraktionen, wie z.B. ER-Mitochondrien-Interaktionen. Nanopartikel des Ost4-EGFP-MTn-Proteins umrissen die ER-Membran in der äußeren Membran der Kernhülle. Ebenso zeigten die Mito-acGFP-MTn-exprimierenden Zellen eine spezifische Markierung in der mitochondrialen Matrix.
