Beginnen Sie mit der Sterilisation von Objektträgern mit Polytetrafluorethylen oder PTFE-Beschichtung, indem Sie sie 10 Minuten lang in einer Biosicherheitswerkbank in 70%iges Ethanol tauchen. Lassen Sie die Objektträger in einer sterilen 100-Millimeter-Zellkulturschale an der Luft trocknen. Legen Sie jeden Objektträger in 1 neue 100-Millimeter-Zellkulturschale und geben Sie 200 Mikroliter serumhaltiges Zellkulturmedium in jedes Rechteck.
Legen Sie dann 20 Minuten lang ein tragbares 254-Nanometer-UV-Licht auf die 100-Millimeter-Zellkulturschale, wobei die Glühbirne direkt auf den Objektträger zeigt. Tauen Sie die gefrorenen Aliquots der äußeren Segmente (OS) in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Drehen Sie dann das Betriebssystem fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.400 G.
Saugen Sie den Überstand in der Biosicherheitswerkbank sofort mit einer Pipette ab und resuspendieren Sie das OS in PBS. Saugen Sie nun das Medium aus den Objektträgern ab und geben Sie bis zu 500 Mikroliter der 2 x 10 bis 8. OS pro Milliliter PBS-Lösung der 2 x 10 bis 8. OS pro Milliliter PBS-Lösung auf jedes Objektträgerrechteck. Platzieren Sie 40 Minuten lang ein tragbares 254-Nanometer-UV-Licht über der Zellkulturschale, wobei die Glühbirne direkt zum Betriebssystem zeigt.
Sammeln Sie die OS-PBS-Lösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie das Rechteck des beschichteten Objektträgers mit 200 bis 500 Mikrolitern PBS und sammeln Sie jede Wäsche im Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie dann die OS-PBS-Lösung bei 2.400 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur herunter.
Saugen Sie das PBS in der Biosicherheitswerkbank mit einem Pipettiergerät ab und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Standardmedium, das für das retinale Pigmentepithel oder die RPE-Kulturen verwendet wird. Geben Sie 10 Mikroliter der Suspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. 50 bis 100 Mal mit mehr Zellkulturmedium verdünnen und das OS mit einem Hämozytometer zählen.
Verdünnen Sie das photooxidierte OS oder die OxOS-Suspension bei einer Konzentration von 5,6 x 10 bis 7 OS pro Milliliter in ein Standard-RPE-Medium. Fügen Sie Phagozytose-überbrückende Liganden hinzu, die die Aufnahme des Betriebssystems und die Akkumulation von Lipofuszin erleichtern. Dann aliquotieren Sie OxOS in Einwegvorräte und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.
Tauen Sie OxOS-Aliquots auf, indem Sie das gefrorene Aliquot in 45 Mikrolitern Zellkulturmedien verdünnen, bevor Sie es zu RPE-Transwellen hinzufügen, um eine Lipofuszin-Akkumulation zu induzieren. Charakterisieren Sie dann das oxidierte OS durch Messung des OxOS-Emissionsspektrums mittels Lambda-Scanning auf einem konfokalen Mikroskop. Die konfokale Bildgebung zeigte, dass das behandelte OS im Vergleich zum unbehandelten OS eine erhöhte Autofluoreszenz aufwies.
