Nehmen Sie zunächst das fixierte Transwell mit Lipofuscin-beladenen RPE-Kulturen. Nachdem Sie die Kulturen fünfmal mit PBS gewaschen haben, lassen Sie eine kleine Menge PBS in der apikalen Kammer. Legen Sie das Transwell kopfüber unter ein Präpariermikroskop.
Schneiden Sie mit einer Rasierklinge die halbporöse Membran aus dem Transwell ab, indem Sie die Schneidkraft an der Verbindungsstelle zwischen Membran und Transwell anwenden. Sobald die Transwell-Membran durchtrennt ist, legen Sie sie mit einer Pinzette auf einen Objektträger. Wischen Sie überschüssiges PBS mit einem Task-Wipe ab und vermeiden Sie es, die Zellen zu berühren.
Fügen Sie Eindeckmedium hinzu, gefolgt von einem Deckglas. Achten Sie darauf, dass Sie den Überblick behalten, welche Seite des Translochs mit der richtigen Seite nach oben liegt. Als nächstes wird das interessierende Antigen mit einem Fluorophor mit einer Spitzenanregung von etwa 488 Nanometern und einer Emissionsdetektion bei 500 bis 530 Nanometern nachgewiesen.
Einrichtung eines separaten Kanals für die Autofluoreszenzdetektion mit 405 Nanometern Anregung und 585 bis 635 Nanometer Emission. Autofluoreszierende Granula, die durch OxOS induziert wurden, zeigten nach 20 Fütterungen eine höhere Akkumulation als nach fünf Fütterungen. Die ratiometrische Bildgebung half bei der Entschlüsselung der UAM-Autofluoreszenz von LC3, das mit Alexa 488 markiert wurde.
Der rote Kanal enthält nur unverdauliches Autofluoreszenzmaterial und trug dazu bei, das LC3-Signal vom grünen Kanal zu trennen.
