Berechnen Sie zunächst die Anzahl der Vertiefungen, die für das Experiment benötigt werden. Tauen Sie dann eine angemessene Menge der regulären Betriebssystemprobe auf. Fügen Sie genügend RPE-Medien hinzu, um eine endgültige Gesamtüberlebenskonzentration von viermal 10 bis zum sechsten pro Milliliter zu erreichen.
Entfernen Sie das apikale Medium und fügen Sie 50 Mikroliter von vier mal 10 zum sechsten OS pro Milliliter mit entsprechenden Konzentrationen von Brückenliganden hinzu. Inkubieren Sie die Proben nach der Zugabe des Betriebssystems zu verschiedenen Zeitpunkten. Am Ende der Inkubation werden 16,67 Mikroliter des vierfachen Laemmli-Probenpuffers mit Proteaseinhibitoren hinzugefügt, um sowohl die Zellen als auch den darüber liegenden OS-haltigen Überstand zu lysieren.
Kratzen Sie mit einer P200-Pipette die Transwell-Oberfläche und sammeln Sie den kombinierten Zellüberstand und das Zelllysat zusammen. Wirbeln Sie vor und lassen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, um eine gründliche Denaturierung zu gewährleisten. Der Western Blot des Rhodopsins zeigte, dass die intakte Rhodopsin-Bande in Kontroll- und UAM-beladenen RPE-Zellen nicht zu unterscheiden war.
Allerdings waren die Spaltprodukte von Rhodopsin in der UAM-Gruppe höher, was auf eine leichte degradative Dysfunktion im phagolysosomalen System hindeutet. Die gleichen GAPDH-Werte zeigen an, dass die Zellzahl zwischen den Vertiefungen gleich ist. Verschiedene Rhodopsin-Antikörper erkennen unterschiedliche Abbaufragmente.
4D2 erkennt den Endterminus von Rhodopsin, der bis zu den letzten Schritten des lysosomalen Abbaus intakt ist. Im Gegensatz dazu erkennt 1D4 den C-Terminus von Rhodopsin, der früher im phagolysosomalen Prozess abgebaut wird.
