Generieren Sie zunächst ein Wildtyp-CaV1.1-CDNA-Konstrukt mit fluoreszenzmarkierten Markierungen. In dieser Arbeit wird eine Plasmidbeschichtung für das verstärkte grün fluoreszierende Protein oder die EGFP-markierte alpha-Untereinheit von Kaninchen Cav1.1 verwendet. Die Anwesenheit des Cytomegalievirus-Promotors ermöglicht eine starke Transfektionseffizienz in den Muskelfasern.
Einführung einer Cystinsubstitution in den Kanal, die mit Hilfe der Fluorometrie unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen, ortsgerichteten Mutagenese-Kits verfolgt werden soll. Dabei werden die Cysteineine an einer Stelle eingebracht, die der Membran-extrazellulären Grenzfläche eines der vier S4 des Kanals entspricht. Mit Hilfe der GFP-Beobachtung und der Ionenstromaufzeichnung wird bestätigt, dass weder das eingesetzte Cystein noch das Vorhandensein von Thiol-reaktivem Farbstoff die Spannungsabhängigkeit und die Leitfähigkeit des Kanals beeinflussen.
