Schalten Sie alle Komponenten der Erfassungseinrichtung für die Fluorometriemessung ein. Stellen Sie die 35 Millimeter große Glasbodenschale mit den dissoziierten Muskelfasern auf den Tisch des Mikroskops. Entfernen Sie das Nährmedium vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette und ersetzen Sie es durch 2 Milliliter Ringerlösung bei Raumtemperatur.
Platzieren Sie die beiden Platindrähte mit einem mechanischen oder motorisierten Manipulator senkrecht zum Boden der Schüssel. Stellen Sie sicher, dass die Elektrodenanschlüsse relativ zur Längsachse der Faser und einige Millimeter von den Enden der Faser entfernt ausgerichtet sind. Passen Sie die Elektrodenpositionierung an, indem Sie die Schüssel drehen oder jede Elektrode bewegen, wenn sie auf einem unabhängigen Mikromanipulator montiert ist.
Schalten Sie das Durchlicht ein und finden Sie die Fasern im Sichtfeld mit einem 20-fachen Objektiv. Bewegen Sie den EGFP-Filterwürfel in den Lichtweg. Aktivieren Sie nach dem Ausschalten des Durchlichts das 488-Nanometer-Anregungslicht mit einem ferngesteuerten Lichtverschluss.
Um die EGFP-positiven Fasern zu identifizieren, zentrieren Sie die Fasern mit dem hellsten EGFP-Signal in der Mitte des Sichtfelds. Verwenden Sie eine Blende, die im Anregungslichtpfad positioniert ist, um das Anregungslicht in einem bestimmten Bereich der Faser zu fokussieren. Dies ermöglicht die Signalerfassung, bei der das EGFP-CaV1.1-Signal maximal ist.
Passen Sie die Faserposition mit dem mechanischen Tisch so an, dass sie mit dem Membranlichtweg übereinstimmt, und speichern Sie die XY-Position der Faser. Nachdem Sie zur ersten gespeicherten Lokalisierung zurückgekehrt sind, stellen Sie die Dauer von zwei aufeinanderfolgenden Stimulationsimpulsen auf 1 Millisekunde, die Amplitude auf 20 Volt und die Polarität der Impulse auf alternierend ein. Verwenden Sie dann einen manuellen Triggerschalter, um die beiden aufeinanderfolgenden Impulse abzugeben.
Beobachten Sie während der Stimulation zwei konzentrische homogene Faserkontraktionen als Reaktion auf die beiden Impulse entgegengesetzter Polarität. Wenn keine Kontraktion oder nur eine konzentrische Kontraktion mit alternierenden Polaritätsimpulsen beobachtet wird, werden die Fasern aus dem Rest des Experiments verworfen. Geben Sie 2 Mikroliter 10 millimolare MTS 5 TAMRA-Lösung direkt in die Schale und mischen Sie sie vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette.
Vier bis fünf Minuten inkubieren, um die Diffusion des fluoreszierenden Thiolmoleküls in das Lumen des transversalen Tubulussystems zu ermöglichen. Wenden Sie durch Feldstimulation bipolare, sich wiederholende Stimulationen an, um aufeinanderfolgende Aktionspotentialzüge mit einer Rate von 50 Hertz für 300 Millisekunden alle 1 Sekunde für 5 Minuten hervorzurufen. Entfernen Sie die Färbelösung mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette aus der Schale.
Und ersetzen Sie es durch 2 Milliliter Ringerlösung bei Raumtemperatur. Lassen Sie die gefärbte Faser mindestens 10 Minuten lang vom Färbeprotokoll erholen. Nachdem Sie den Faserzustand und die elektrische Aktivität mit zwei abwechselnden Impulsen neu bewertet haben, bewegen Sie den MTS 5 TAMRA-Filterwürfel in den Lichtweg und aktivieren Sie das 533-Nanometer-Anregungslicht mit einem ferngesteuerten Lichtverschluss, um die Färbung auf den Fasern visuell zu bestätigen.
Als nächstes platzieren Sie die Faser an der gespeicherten Stelle auf dem motorisierten Tisch in der Mitte des Feldes mit dem MTS 5 TAMRA-Filterwürfel, der Membran und dem 60X-Ölimmersionsobjektiv. Nachdem Sie die Platindrähte der Feldstimulation an jedem Ende der Faser neu ausgerichtet haben, richten Sie die Drähte auf der Hauptachse der Fasern in einer geraden Linie aus und platzieren Sie sie in einem Abstand von fünf Millimetern, wobei sich die Faser in der Mitte befindet. Wählen Sie in der Erfassungssoftware das Protokoll aus, das für die Erfassung verwendet werden soll.
Dieser Schritt wird nur mit dem Computer gesteuert und löst alle nachgeschalteten Geräte für die elektrische Stimulation und die Steuerung des Lichtwegverschlusses aus. Minimieren Sie für jedes Protokoll die Gesamterfassungszeit so weit wie möglich, um ein Ausbleichen des Signals zu vermeiden, aber lassen Sie vor der ersten elektrischen Stimulation einige Dutzend Millisekunden Lichtbeleuchtung und Signalerfassung ein, um eine Basislinie aufzuzeichnen. Führen Sie das Protokoll aus, indem Sie auf Ausführen klicken.
Das aufgezeichnete Signal wird automatisch auf dem Bildschirm angezeigt. Die geringe Amplitude des Signals und die schnelle mechanische Kontraktion der Faser verbergen oft den größten Teil des Signals und zeigen ein Bewegungsartefakt. Fügen Sie der Aufzeichnungslösung 1 Mikromolar von 100 Millimolar und Benzoylparatoluolsulfonamid hinzu, um die vertraglichen Reaktionen zu minimieren und das Signal, das sich aus S4-Bewegungen aufgrund der Faseraktivierung ergibt, weiter zu unterscheiden.
Führen Sie nach einigen Minuten dasselbe Protokoll ein zweites Mal aus. Das Bewegungsartefakt ist nun entfernt, aber eine kleine Fluoreszenzänderung, die der S4-Bewegung entspricht, bleibt erhalten. Bewegen Sie die Schüssel mit der mechanischen Stufe leicht, um ein Signal aus einem Bereich ohne Fasern oder Schmutz zu erhalten.
Führen Sie das Protokoll ein letztes Mal aus, um die Hintergrundfluoreszenz aufzuzeichnen. Exportieren Sie die Leiterbahnen, und verwenden Sie ein Tabellenkalkulationsprogramm, um das Signal als Delta f über f 0 in Abhängigkeit von der Zeit auszudrücken, und wenden Sie bei Bedarf eine Basislinienkorrektur an. Die Beispiele für transmittierte und fluoreszierende Bilder des präparierten und nicht dissoziierten Muskels, die ein EGFP-CaV1.1-Konstrukt exprimieren, sind hier dargestellt.
Die repräsentativen Bilder einer Muskelfaser, die ein EGFP CaV1.1 VS D3-Konstrukt exprimiert, vor und nach der MTS 5 TAMRA-Färbung sind in dieser Abbildung dargestellt. Dieser Farbstoff färbt auch körpereigene Cysteineine, die nicht transfiziert sind. Die konfokalen Aufnahmen eines EGFP CaV1.1 VS D3 Konstrukts und der MTS 5 TAMRA Färbung zeigen ein Doppelbandenmuster, das für die CaV1.1-Lokalisation auf dem transversalen Tubulussystem der Muskelfaser charakteristisch ist.
Die repräsentative fluorometrische Aufnahme als Reaktion auf zwei Stimuli und gemessen mit einer Fotodiode ist hier dargestellt. Beide Signale werden durch ihren Minimalwert normiert und als Funktion der Zeit relativ zu ihrer jeweiligen Depolarisation aufgetragen. Diese Aufnahmen zeigen, dass die Anstiegsphase und die Zeit bis zum Höhepunkt des Signals für beide Depolarisationen, die der Faser auferlegt werden, ähnlich sind.
