Um mit der Probenvorbereitung zu beginnen, wird das echte Blatt aus der pharmakologisch behandelten transgenen Arabidopsis thaliana-Probe mit einer scharfen Rasierklinge präpariert. Lege das echte Blatt mit der abaxialen Seite nach oben auf einen Objektträger in einen Wassertropfen. Decken Sie das echte Blatt langsam mit einem Deckglas ohne Luftblasen ab.
Für die Bildgebung richten Sie den Strahlengang ein, indem Sie einen 514-Nanometer-Laser für die Anregung des gelb fluoreszierenden Proteins oder YFP auswählen. Erzielen Sie eine hohe Bildqualität durch den Einsatz einer hohen Laserleistung. Schalten Sie PMT oder HYD ein und definieren Sie die oberen und unteren Emissionsbandschwellen basierend auf dem Spektrum für den YFP-Fluorophor.
Stellen Sie ein Detektionsfenster von 530 bis 570 Nanometern ein, um das YFP-Signal zu erfassen. Für das sequentielle Bild der zweiten Farbe klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen und fügen Sie einen neuen Kanal hinzu. Wählen Sie in der zweiten Suche einen 555-Nanometer-Laser für das rot fluoreszierende Protein oder die RFP-Anregung aus und stellen Sie ein Detektionsfenster von 570 bis 630 Nanometern ein, um das RFP-Signal zu erfassen.
Wählen Sie eine 63-fache 1,2-W-Kernlinse auf dem System aus, um die subzelluläre Membranverkehrsaktivität in stomatalen Vorläuferzellen abzubilden. Beginnen Sie das Format mit einer Bildgröße von 1024 x 1024 Pixeln und optimieren Sie es dann basierend auf dem Zoomfaktor und den Objektiveinstellungen für eine gute Auflösung. Als nächstes stellen Sie die Geschwindigkeit des Scankopfes ein, beginnend mit einer Geschwindigkeit von 400 Hertz, und optimieren Sie diese basierend auf der spezifischen Situation der Proben.
Um auf einen Interessenbereich zu zoomen, ohne das Objektiv zu wechseln, geben Sie einen Zoomfaktor von eins ein und optimieren Sie diesen basierend auf den spezifischen Anforderungen des Experiments. Der Zeilendurchschnitt bezieht sich auf die Häufigkeit, mit der jede X-Zeile gescannt wird, um ein durchschnittliches Ergebnis zu erhalten. Beginnen Sie mit einem 2-fachen Linienmittelwert für die Abbildung der Membrantransportereignisse und optimieren Sie diese nach Bedarf.
Wählen Sie den XYT-Scanmodus im Erfassungsmodus aus, um das Zeitreihendienstprogramm zu aktivieren. Wählen Sie als Nächstes unter Zeitintervall die Wartezeit zwischen den Zeitpunkten aus. Definieren Sie die Anzahl der zu erfassenden Frames, indem Sie Frames auswählen.
Verwenden Sie den Z-Stapel-Scan-Modus mit der maximalen Intensitätsprojektion, um die dreidimensionalen Informationen über das Membrantransportereignis innerhalb der gesamten Zelle zu sammeln. Wählen Sie dann den XYZ-Scanmodus im Erfassungsmodus aus, und dann wird das Z-Stapel-Dienstprogramm zugänglich. Wählen Sie die Option Z-breit aus.
Definieren Sie im Scanmodus die oberen und unteren Bilder des Z-Stapels mit den Schaltflächen "Start" und "Ende". Definieren Sie als Nächstes die Dicke des Z-Schritts, indem Sie auf die Z-Schrittweite klicken. Um das Bild zu verarbeiten, klicken Sie in der Confokal-Software auf die Registerkarte "Primärer Prozess".
Wählen Sie auf der Registerkarte "Geöffnete Projekte" ganz links die gewünschte Z-Stack-Datei aus. Wählen Sie dann auf der mittleren Registerkarte mit dem Namen Prozesswerkzeuge die Projektionsfunktion aus. Wählen Sie im Dropdown-Bereich der Methode das Maximum aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden.
Ein Z-Stapel-Projektionsbild wird auf der Registerkarte "Projekte öffnen" generiert. Um das Video aus den Zeitreihenbildern zu generieren, klicken Sie auf die Registerkarte "Datei" in der Fidschi-Software und öffnen Sie die Funktion, um alle Zeitreihenbilder nacheinander in der richtigen Reihenfolge zu öffnen. Alternativ können Sie die Bilder auf Bild J ziehen, um die Daten in der richtigen Reihenfolge zu öffnen.
Suchen Sie dann die Stapelfunktion auf der Registerkarte "Bild" und wählen Sie die Bilder aus, die gestapelt werden sollen, um ein Video zu erstellen. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Datei im AVI-Format mit der gewünschten Bildrate. Im echten Blatt von sieben Tage alten transgenen Pflanzen, die den ERL1-Promotor ERL1 YFP tragen, wurden verstreute Zellen durch das YFP-Signal hervorgehoben, wobei ERL1 YFP die Plasmamembran markierte.
Es wurden auch mehrere punktförmige Signale beobachtet, was darauf hindeutet, dass ERL1 auch in den Endosomen lokalisiert war. RFP Ara7 markierte mehrere punktförmige Signale in fast allen Zellen, was auf die multivesikulären Körper (MVBs) in diesen Zellen hindeutet. Als RFP Ara7 mit dem ERL1 YFP-Signal verschmolz, überlappten sich die meisten Punkte, was darauf hindeutet, dass einige ERL1 YFP-Moleküle zu den MVBs transportiert wurden.
Zeitreihen von echten Blättern, die ERL1 YFP und das MVB-Markerprotein RFP Ara7 trugen, zeigten, dass sich YFP-markierte Endosomen zusammen mit RFP Ara7 innerhalb der Stomatazellen bewegten. Es wurde bestätigt, dass ERL1 YFP auf den multivesikulären Körpern lokalisiert war.
