Entfernen Sie in einer Biosicherheitswerkbank das Fettgewebe der Maus mit einer sterilen Pinzette. Sobald überschüssiges PBS entfernt ist, geben Sie das Gewebe in eine andere Petrischale und waschen Sie es zweimal für jeweils fünf Minuten mit 10 Millilitern PBS AA-Lösung. 20 Milliliter der vorbereiteten Kollagenase-Lösung in ein Kristallbecherglas geben, das ein Quadratzentimeter großes, fragmentiertes Gewebe und einen Magnetstab enthält.
Das verschlossene Becherglas bei 37 Grad Celsius unter ständigem Rühren inkubieren. Filtern Sie das Homogenat durch einen 40-Mesh-Edelstahl-Öffnungsfilter mit 0,38 Millimetern auf einer Petrischale und sammeln Sie die Zellsuspension in einem sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie die stromale Gefäßfraktion vorsichtig in 20 Millilitern warmem, ergänztem DMEM und zentrifugieren Sie die Suspension.
Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 40 Millilitern nicht supplementiertem DMEM-Medium. Suspendieren Sie den Gaumen in fünf Millilitern supplementiertem DMEM. Die Suspension in eine 25 Quadratzentimeter große T-Flasche umfüllen und inkubieren.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit fünf Millilitern warmem PBS AA und zweimal mit nicht supplementiertem DMEM. Um Zellreste und nicht-murine Zellen zu entfernen, fügen Sie fünf Milliliter frisches, warmes, zugeführtes DMEM hinzu und wechseln Sie das Medium alle drei bis vier Tage. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 90 bis 100 % erreicht haben, fügen Sie den mit DMEM gewaschenen Zellen einen Milliliter warme Trypsin-EDTA-Lösung hinzu.
Fünf bis sieben Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie der abgelösten Zellmonoschicht vier Milliliter zugesetztes DMEM hinzu und disaggregieren Sie die Suspension schonend. Suspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern warmem, zugesetztem DMEM.
Mischen Sie das Pellet nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstandes vorsichtig mit einem Milliliter zugesetztem DMEM. Färben Sie die Zellen mit Trypanblau ein und zählen Sie sie in einer Neubauer-Kammer. Samenzellen in T-75-Flaschen.
Um die Bildung von Kolonien und eine hohe Proliferation zu gewährleisten, ist die Morphologie der Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Zellen unter einem Lichtmikroskop zu beobachten. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung zeigt ausgedehntes Zytoplasma mit länglichen Verlängerungen und reichlich intrazellulären Mikrofilamenten.
