Am ersten Tag nach der Chromatinvernetzung und der Zellkernentnahme von 5.000 jungen erwachsenen Caenorhabditis elegans-Würmern wird das in 450 Mikroliter sauberem Wasser resuspendierte Zellkernpellet in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dann 60 Mikroliter 10X DPN2 Restriktionsenzympuffer dazugeben und gut vermischen. Inkubieren Sie die Proben mit 15 Mikrolitern 10%igem Natriumdodecylsulfat bei 37 Grad Celsius für eine Stunde unter Rühren.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 75 Mikrolitern 20%Triton X 100 abgeschreckt und wie zuvor gezeigt inkubiert. Aliquotieren Sie 10 Mikroliter aus der Probe als unverdaute Kontrolle und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie dem Rest der Probe 400 Einheiten DPN 2 zugesetzt haben, inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Rühren für den Chromatinaufschluss.
Fügen Sie der Probe am zweiten Tag weitere 200 Einheiten DPN 2 hinzu. Um den Aufschluss der vernetzten Probe abzuschließen, inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Rühren. Inaktivieren Sie das Restriktionsenzym, indem Sie die Probe 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubieren.
Wenn das Enzym nicht durch Hitze inaktiviert werden kann, fügen Sie 80 Mikroliter 10%iges Natriumdodecylsulfat hinzu und inkubieren Sie. Geben Sie dann 375 Mikroliter 20%Triton X 100 in die Probe und mischen Sie sie durch Schwenken. Bewahren Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot aus der Probe als Aufschlusskontrolle auf.
Für die Chromatinligatur wird die Probe in ein sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Stellen Sie das Probenvolumen mit molekularem Wasser auf 5,7 Milliliter ein und mischen Sie es durch Schwenken. Fügen Sie dann 700 Mikroliter 10 x T4-Ligasepuffer hinzu, gefolgt von 60 Einheiten T4-DNA-Ligase, und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 16 Grad Celsius.
Fahren Sie am dritten Tag mit der Proteinverdauung und der umgekehrten Vernetzung fort. 30 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Proteinase K in die 3C-Probe geben und über Nacht bei 65 Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Um am vierten Tag mit der Aufreinigung der 3C-Bibliothek zu beginnen, geben Sie 30 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter RNase A in die Probe und mischen Sie sie durch Schwenken.
Nach der Inkubation sieben Milliliter Phenylchloroform in die Proben geben und durch Schütteln mischen. Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 3.270 g und Raumtemperatur. Die wässrige Phase auffangen und in ein sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführen.
Fügen Sie gleiche Mengen Chloroform hinzu und mischen Sie die Probe durch Schütteln. Nach erneutem Zentrifugieren der Probe wie gezeigt wird die wässrige Phase in ein weiteres sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie 7,5 Milliliter Wasser in molekularer Qualität, 35 Milliliter 100%Ethanol und sieben Mikroliter ein Milligramm pro Milliliter Glykogen hinzu.
Frieren Sie die richtig gemischte Probe bei minus 80 Grad Celsius ein. Während die Probe gefriert, beginnen Sie mit der Reinigung der Kontrollproben, indem Sie das Volumen der Kontrollen mit Wasser in molekularer Qualität auf 500 Mikroliter einstellen. Fügen Sie zwei Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter RNase A hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen anschnippen.
Als nächstes geben Sie einen Milliliter Phenylchloroform in die Röhrchen mit den Kontrollen und mischen Sie es durch Schütteln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen. Nachdem die wässrige Phase in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt wurde, fügen Sie gleiche Mengen Chloroform hinzu.
Zentrifugieren Sie wie zuvor gezeigt, bevor Sie die wässrige Phase sammeln. In die gesammelte wässrige Phase werden ein Milliliter Ethanol und zwei Mikroliter ein Milligramm pro Milliliter Glykogen gegeben. Nachdem Sie die Probe durch Schütteln gemischt haben, inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius.
Anschließend wird die Probe 15 Minuten lang bei 3.270 G bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, fügen Sie 750 Mikroliter gekühltes 70%iges Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie. Suspendieren Sie das luftgetrocknete Pellet erneut in 50 Mikrolitern molekularem Wasser.
Die Aussetzung kann hier eingefroren werden, wenn nicht sofort weitergefahren wird. Um mit der 3C-Probenreinigung fortzufahren, nehmen Sie die Probe aus dem Gefrierschrank und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei 3.270 g. Fügen Sie 10 Milliliter gekühltes 70%iges Ethanol hinzu und brechen Sie das DNA-Pellet auf.
Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands wird die Probe teilweise bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Das Pellet wird in 150 Mikrolitern 10 Millimolar Tris HCL bei einem pH-Wert von 7,5 durch Auf- und Abpipettieren erneut suspendiert, um die gereinigte 3C-Bibliothek zu erhalten. Die QPCR, die an einer experimentellen und zwei kontrollierten 3C-Proben durchgeführt wurde, half bei der Generierung der Daten zur Aufschlusseffizienz.
Die 3C-Probe wies eine Aufschlusseffizienz von etwa 88 % an den sieben getesteten genomischen Loci auf.
