Beginnen Sie damit, eine sieben bis acht Wochen alte, eingeschläferte männliche Maus auf eine saubere Bankoberfläche zu legen. Schneiden Sie die Bauchhaut der Maus mit einer Schere in Richtung Unterbauch auf. Entfernen Sie das Fettgewebe von den Innenseiten der Oberschenkel.
Das herausgeschnittene Gewebe wird in Röhrchen C auf Eis gelegt, das 2,5 Milliliter einer Enzymmischung aus den Enzymen D, R, A und 2,35 Milliliter DMEM/F12 ohne FBS oder Antibiotika enthält. Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer Schere in etwa zwei Quadratmillimeter große Stücke. Schließen Sie die Kappe von Röhrchen C fest und drehen Sie das Röhrchen um.
Befestigen Sie das Röhrchen an der Hülse eines Gewebedissoziators und verdauen Sie die Proben 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend DMEM/F12-Medien mit FBS und Antibiotika auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Röhrchen C aus dem Gewebedissoziator und stoppen Sie die Verdauung, indem Sie fünf Milliliter DMEM/F12 mit FBS und Antibiotika hinzufügen.
Viermal vorsichtig pipettieren. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 700 g für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Ohne die Zellpalette zu stören, saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter DMEM/F12, das FBS und Antibiotika enthält, und pipettieren Sie es vorsichtig fünfmal. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein Zellsieb mit einem Durchmesser von 70 Mikrometern, das auf einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 250 g für fünf Minuten.
Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS. Vor dem Plattieren wird die Zellsuspension bei 500 g fünf Minuten lang zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter DMEM/F12, das FBS und Antibiotika enthält. Mischen Sie, indem Sie die Suspension 10 Mal vorsichtig pipettieren. Legen Sie 10 Milliliter der Suspension auf eine 10 Zentimeter dicke, mit Kollagen beschichtete Schale.
Stellen Sie die Schale in einen Zellkultur-Inkubator. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen dreimal mit drei Millilitern PBS pro Waschgang. 10 Milliliter DMEM/F12 mit FBS und Antibiotika zugeben und inkubieren.
Die Ölrot-O-Färbung zeigte lipidbeladene Adipozyten sieben Tage nach Induktion der Adipozytendifferenzierung. Der Grad der vollständigen Differenzierung wurde durch mRNA-Expressionsanalysen von Adipogenese-Regulatoren bestätigt. Rosiglitazon induzierte einen dosisabhängigen Effekt auf die Expression von braunfettspezifischen Genen wie Ucp1 und Ppargc1a.
Für Fabp4 sättigte sich der Effekt jedoch bei einer Rosiglitazonkonzentration von 0,1 Mikromol. Differenzierte Adipozyten können für verschiedene funktionelle und mechanistische Analysen verwendet werden, wie z. B. die Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate und die Chromatin-Immunpräzipitation.
