Vor der Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung wird das Gewebe fixiert und eine Entparaffinierung und endogene Peroxidase-Hemmung durchgeführt. Für die immunfluoreszierende Multiplex-Färbung tauchten die Objektträger dann in ein 300-Milliliter-Färbegefäß mit 10 Millimolarcitratpuffer, ergänzt mit 0,1 % Triton X-100. Stellen Sie das Färbeglas bei geschlossenem Deckel für drei bis fünf Minuten bei maximaler Leistung in die Mikrowelle, bis der Puffer zu kochen beginnt.
Lassen Sie den Puffer nach dem Kochen auf nahezu Siedetemperatur, indem Sie die Mikrowelle 15 Minuten lang auf niedrige Leistung stellen. Erhitzen Sie den Puffer erneut, indem Sie die Mikrowelle 90 Sekunden lang auf maximale Leistung stellen. Nehmen Sie das Glas aus der Mikrowelle und lassen Sie den Puffer 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen.
Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in destilliertem Wasser, gefolgt von fünf Minuten Spülen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 oder TBS Tween. Entfernen Sie nach dem letzten Waschgang den TBS Tween, indem Sie die Objektträger auf ein Papiertuch tupfen. Legen Sie die Objektträger anschließend auf einen Objektträgerkasten und umkreisen Sie das Gewebe mit einem hydrophoben Stift.
Blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen, indem Sie das Gewebe mit 5%BSA bedecken, das in TBS Tween gelöst ist. Entfernen Sie nach 30 Minuten den blockierenden Puffer, indem Sie die Objektträger auf ein Papiertuch tupfen. Anschließend wird das Gewebe 60 Minuten lang mit 300 Mikrolitern Primärantikörper, verdünnt in 1 % BSA, TBS Tween, inkubiert.
Nach der Inkubation werden die Objektträger dreimal für jeweils drei Minuten mit TBS Tween gespült. Inkubieren Sie das Gewebe nach dem Waschen 40 Minuten lang mit 300 Mikrolitern Poly-HRP-Sekundärantikörper. Nach der Inkubation werden die Objektträger dreimal für jeweils drei Minuten mit TBS Tween gespült.
Als nächstes inkubieren Sie das Gewebe 10 Minuten lang mit 300 Mikrolitern Fluorochromtyramid-Reagenz, das 200-fach in Boratpuffer verdünnt und mit 0,003%igem Wasserstoffperoxid ergänzt wird. Anschließend werden die Objektträger dreimal mit TBS Tween gespült und das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius mit humanem Pan-Cytokeratin-Antikörper inkubiert, der in 1 % BSA, TBS Tween verdünnt ist. Am nächsten Tag wird das Gewebe mit TBS Tween gespült und 120 Minuten lang mit dem Sekundärantikörper inkubiert, der direkt mit Fluorochrom gekoppelt ist, das 200-fach in 1%BSA, TBS Tween, verdünnt ist.
Nach der Inkubation wird das Gewebe mit TBS Tween gespült, bevor die Zellkerne mit BisBenzimid, 1.000-fach verdünnt in 10 % BSA, TBS Tween für fünf Minuten gefärbt werden. Spülen Sie das Gewebe dreimal für jeweils drei Minuten in destilliertem Wasser ab, bevor Sie es mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium und Borosilikat-Deckglas auf einen Objektträger montieren. Importieren Sie für die Bildanalyse die Scans in eine Bildanalysesoftware.
Wechseln Sie dann zur Registerkarte Analyse und wählen Sie den High-Plex-Fluoreszenzalgorithmus aus, indem Sie auf Einstellungen, Aktionen und dann auf Laden klicken. Wählen Sie die Registerkarte Farbauswahl und den gewünschten Farbstoff aus. Gehen Sie auf der Registerkarte "Nukleare Erkennung" zu "Nuklearer Segmentierungstyp" und wählen Sie "AI Custom" aus.
Wählen Sie dann im Klassifikator für die Kernsegmentierung die gespeicherte trainierte AI.In der Registerkarte Membran- und Zytoplasmatdetektion aus, wählen Sie den maximalen Zytoplasmaradius und die Anzahl der Membranfarbstoffe aus. Wählen Sie für jeden Farbstoff den Schwellenwert für den positiven Zellkern, den Schwellenwert für den positiven Zytoplasma und den Schwellenwert für den positiven Membranspiegel aus. Wählen Sie für jeden Farbstoff die Werte für den Zellkern, die Membran und das Zytoplasma aus.
Speichern Sie den Algorithmus, indem Sie Einstellungen, Aktionen und Speichern auswählen. Analysieren Sie den Interessenbereich, indem Sie auf Analysieren klicken und Annotation-Layer auswählen. Gehen Sie dann zur Registerkarte Ergebnisse und wählen Sie alle Daten in Objektdaten aus.
Exportieren Sie die Daten im CSV-Format, indem Sie mit der rechten Maustaste auf Exportieren klicken und objectdata.csv auswählen. Es zeigt sich ein repräsentatives Ergebnis der optimalen Färbung mittels Multiplex-Immunfluoreszenz. Die Wahl der richtigen Verdünnung war entscheidend, um die Spezifität der Antikörper zu überprüfen und das Signal-Rausch-Verhältnis der Färbung zu optimieren.
