Mahlen Sie zunächst 10 Milligramm gefriergetrocknetes Mycobacterium paratuberculosis mit einem Mörser und Stößel zu einem feinen Pulver. Fügen Sie fünf Milliliter des unvollständigen Freund-Adjuvans hinzu, um eine Stammlösung von 10 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Lagern Sie die Brühe bei minus vier Grad Celsius.
Vor der Immunisierung die Stammlösung verdünnen. Anschließend wird das Peptid MOG 35-55 auf zwei Milligramm pro Milliliter verdünnt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert. MOG 35-55 in gleicher Menge mit dem Adjuvans in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen mit einem Homogenisator mischen, bis eine dickflüssige Emulsion entsteht.
Geben Sie die Lösung nach jeweils 10 Sekunden des Mischens für 20 Sekunden auf Eis und drehen Sie das Röhrchen, um die gesamte Lösung zurückzugewinnen. Übertragen Sie die Emulsion in eine Ein-Milliliter-Spritze und stellen Sie sicher, dass sie frei von Luftblasen ist. Passen Sie es dann mit einer 27-Gauge-Nadel an.
Injizieren Sie subkutan 200 Mikroliter der Emulsion in den unteren Rücken einer anästhesierten Maus. Injizieren Sie dann intraperitoneal eine Dosis Pertussis-Toxin am Tag null und zwei nach der Immunisierung. Alle Mäuse zeigten eine akute monophasische Erkrankung, die durch einen einzigen Höhepunkt der Behinderung nach 14 bis 17 Tagen gekennzeichnet war, gefolgt von einer teilweisen Erholung der Symptome in den nächsten 10 Tagen.
Mäuse, die mit M. paratuberculosis immunisiert wurden, zeigten einen früheren Beginn nach der Immunisierung und einen höheren Schweregrad in der akuten Phase. Beide Gruppen wiesen ein ähnliches Körpergewicht auf. Proliferationsassays mit titriertem Thymidin-Einbau an den Milzzellen der EAE-Mäuse zeigten eine starke proliferative Antwort auf das Peptid MOG 35-55, nicht aber auf Ovalbumin.
Die zytofluorometrische Analyse zeigte erhöhte T-Lymphozyten, dendritische Zellen und Monozyten in der Milz von M. paratuberculosis-immunisierten EAE-Mäusen im Vergleich zu CFA-immunisierten Mäusen. Die Hämatoxylin- und Eosin-Gewebeanalyse ergab eine typische paravaskuläre und meningeale mononukleäre Entzündungsinfiltration im Gehirn und Rückenmark.
