Beginnen Sie mit der Entnahme von 500 bis 1000 Nanogramm der seltenen Zell-DNA-Bibliothek. Trocknen Sie die DNA mit einem Vakuumkonzentrator und resuspendieren Sie sie in 3,4 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Nach der Zugabe der Blocker und auf dem Thermocycler bei 65 Grad Celsius wird die Hybridisierungslösung mit der biotinylierten RNA in die blockierte Bibliothek überführt.
Nach festem Verschließen des Röhrchendeckels über Nacht bei 65 Grad Celsius im Thermocycler inkubieren. Übertragen Sie dann 50 Mikroliter T1-Streptavidin-Kügelchen pro Probe in ein 1,5-Milliliter-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung und platzieren Sie es auf einem 1,5-Milliliter-Röhrchenmagneten. Sobald alle Perlen an der Wand kleben, entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Perlen zurück.
Waschen Sie nun die Kügelchen dreimal mit 200 Mikrolitern des Bindepuffers aus dem Target Enrichment Kit und resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikroliter Bindepuffer. Übertragen Sie die Probe auf den Thermocycler auf die resuspendierten Beads und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Nachdem Sie die Perlen mit 200 Mikrolitern Waschpuffer 1 gewaschen haben, inkubieren Sie sie 15 Minuten lang und drehen Sie sie bei Raumtemperatur.
Anschließend werden die Kügelchen dreimal mit 200 Mikrolitern Waschpuffer 2 auf 65 Grad Celsius erhitzt gewaschen und in einem Thermoblock inkubiert. Nach der Amplifikation der Bibliothek durch PCR wird schließlich eine DNA-Aufreinigung mit paramagnetischen Beads durchgeführt, indem der Probe 270 Mikroliter Stock-Beads hinzugefügt und durch Vortexen gemischt werden. Ein automatisiertes Elektrophoreseprofil aus einer Bibliothek lieferte kurz vor der Erfassung 49,7 Nanogramm pro Mikroliter DNA in 20 Mikrolitern Reaktionsvolumen.
3,06 Nanogramm pro Mikroliter DNA werden jedoch aus einem hochempfindlichen automatisierten Elektrophoreseprofil aus einer fertigen laugungstechnischen Bibliothek gewonnen.
