Zeichnen Sie mit einer Eikerze mit einem Bleistift den Umfang der Lufttasche über dem E14- oder E15-Embryo nach und bedecken Sie den umrissenen Bereich mit transparentem Klebeband. Schneiden Sie mit einer gebogenen oder feinen Schere vorsichtig um den nachgezeichneten Bereich herum. Achten Sie darauf, nicht in die Embryomembran oder die Blutgefäße zu schneiden.
Entsorgen Sie dann das obere Stück der Schale. Nachdem Sie den Kükenembryo enthauptet haben, legen Sie den Kopf in eine 10 Zentimeter lange Schale mit einer kalten, sterilen CMF-Lösung. Ziehen Sie mit einer sterilen, feinen Pinzette die Haut ab, die das Gehirn bedeckt, um die darunter liegende Dura mater freizulegen.
Entfernen Sie die sich bildenden Schädelknochen auf der linken und rechten Seite des Gehirns. Die sich bildenden Schädelknochen bedecken noch nicht den größten Teil des Gehirns. Reißen Sie vorsichtig mit einer feinen, spitzen Pinzette durch die Hirnhäute, die über der Mitte des Gehirns liegen, und ziehen Sie sie zu jeder Seite ab, um das Gehirn freizulegen.
Schöpfen Sie das Gehirn mit einer fein gebogenen Pinzette von unten nach oben und ziehen Sie es vorsichtig aus seiner Höhle. Zerlegen Sie das Gehirn in seine drei Hauptteile: Vorderhirn, Mittelhirn oder optische Tecta und Kleinhirn. Entfernen Sie die darüber liegende Pia mater mit einer feinen Pinzette aus der Tecta und legen Sie die präparierten Hirnregionen in eine kleine sterile Schale auf Eis.
Um das Gehirn einzubetten und zu schneiden, nehmen Sie vorsichtig entweder das optische Tectum oder die Vorderhirnregion mit einer gebogenen Pinzette als Schaufel auf und tupfen Sie sie leicht auf sterile Gaze, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Bereiten Sie eine einfache Form vor, indem Sie Aluminiumfolie um ein Objekt entsprechend großer Größe formen. Hier wird ein kleiner rechteckiger vibrierender Gewebeschneideblock aus Metall als Objekt verwendet.
Verwenden Sie eine sterile Transferpipette und füllen Sie die Form mit niedrig schmelzender Agarose. Legen Sie die Hirnregion schnell in Agarose und lassen Sie sie etwa vier bis fünf Minuten auf Eis erstarren. Schneiden Sie die Abschnitte auf einem vibrierenden Taschentuchschneider mit einem Saphirmesser.
Verwenden Sie den sterilen Spatel, um die Scheibe aufzunehmen und aus dem Tablett zu nehmen. Schieben Sie den Abschnitt vorsichtig mit einem anderen sterilen Spatel vom Spatel auf einen Membraneinsatz. Legen Sie die Sechs-Well-Platte mit Hirnscheiben auf Membraneinsätze in den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Verwenden Sie am Tag nach dem Plattieren eine sterile Pasteurpipette, um das Medium von unterhalb des Einsatzes abzusaugen, und geben Sie einen Milliliter frisches Scheibenmedium in jede Vertiefung unter dem Membraneinsatz. Um die GBM-Zellen in die Gehirnschnitte einzuführen, entfernen Sie anschließend ein bis mehrere Sphäroide aus ihrer Kulturschale mit einer 20-Mikroliter-Mikropipette, die auf fünf Mikroliter eingestellt ist. Stoßen Sie das Medium mit den Sphäroiden vorsichtig auf die gewünschte Hirnscheibe aus und lassen Sie die Sphäroide zwei bis fünf Tage lang auf der Scheibe kultivieren.
Die Viabilitätsergebnisse von x vivo optischen Tectumschnitten nach einer Woche in Kultur sind in dieser Abbildung dargestellt. Die konfokalen Aufnahmen eines Hirnschnitts, der mit Bisbenzimid auf Zellkerne und mit Laminin immungefärbt wurde, zeigen deutlich normale und intakte Blutgefäße, die optisch in verschiedenen Konfigurationen geschnitten sind. Das maximale Projektionsbild des konfokalen Z-Stapels des Hirnschnitts, gefärbt auf SOX 2 Transkriptionsfaktor und Gesamtkerne mit Bisbenzimid, ist hier dargestellt.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Gehirnschnitte von Kükenembryonen etwa zwei Wochen lang auf Membraneinsätzen kultiviert werden können und mit normal aussehenden Blutgefäßen und Transkriptionsfaktorexpression lebensfähig bleiben.
